蛋白翻译后修饰科普专题——走近泛素化

蛋白翻译后修饰科普专题——走近泛素化
泛素化修饰蛋白质组作为组学手段进入大家视野并不久，但是泛素化修饰的研究由来已久，最早可追溯到1975年！2004年，Ciechanover, Hershko 和 Rose 因发现泛素介导的蛋白质降解共同获得诺贝尔化学奖。

近十年来Ubiquitination 相关文章高达17000篇，其中组学“Ubiquitination+proteome”500篇，仅占3%，细分到不同研究方向上泛素化修饰组学研究更是少之又少。

2019年10月27日，中国生物化学与分子生物学会2019 年会“蛋白质功能与修饰”专题进行修饰学术分享的老师，九成涉及泛素化！由此可见，泛素化具有广阔的应用前景。

本文，小编抛砖引玉简要总结一下泛素化修饰。

内容分为五个模块：
1. 泛素化修饰简述
2. 泛素及泛素连接方式
3. 泛素酶及泛素化修饰过程
4. 质谱鉴定泛素化修饰蛋白的原理
5. 泛素化修饰的生物学功能
1
泛素化修饰简述
一个或多个泛素分子在一系列酶的作用下与底物蛋白质分子共价结合的翻译后修饰过程称为泛素化修饰(Ubiquitination/Ubiquitylation)。

泛素化修饰在细胞生命周期各个方面，通过对蛋白质稳定性、定位、活性以及相互作用的调控，广泛参与了诸如转录调节、DNA 损伤修复、细胞周期、细胞凋亡、囊泡运输等生理过程。

2
泛素及泛素连接方式
泛素(ubiquitin, Ub)是一种由76个氨基酸组成的小分子蛋白质，高度保守，全长包含7个赖氨酸位点(K6, K11, K27, K29, K33, K48和K63)和1个位于C 端的甘氨酸(Gly)位点以及位于N 端的甲硫氨酸(Met)位点。

泛素化修饰分类及泛素连接方式：
1）如果靶蛋白结合单个泛素分子，则称为单泛素化；2）如果靶蛋白的多个 Lys 残基同时被单个泛素分子标记称为多泛素化；3）而靶蛋白的单个 Lys 残基被多个泛素分子标记则称为多聚泛素化。

目前报道的多聚泛素化修饰主要有8种不同类型的连接方式，其中7种涉及泛素链内部赖氨酸 K 与泛素分子 C 末端的甘氨酸 G 相连接方式，包括 K6、K11、K27、K29、K33、K48 和 K63 位的多聚泛素化修饰。

研究比较多的是 K48 位和 K63 位多聚泛素化修饰，其中 K48 位的多聚泛素化修饰主要起到降解的作用，K63 位的多聚泛素化修饰
主要起到信号转导与 DNA 修复的功能。

2006年发现第8种类型的泛素链连接方式即线性泛素化修饰，其泛素链的连接方式是由泛素甲硫氨酸 Met 的氨基基团与另一泛素甘氨酸的羧基相连形成泛素链标记。

目前研究表明线性泛素化修饰在先天性免疫和抑制炎症反应等多种过程中发挥着非常重要的作用。

图1 泛素链的连接方式[1]A：K48 多聚泛素化泛素链的连接方式 B：线性泛素化泛素链的连接方式
3
泛素酶及泛素化修饰过程
泛素化过程通常需要3种泛素化酶的协同作用: E1泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme)、E2 泛素偶联酶(ubiquitin-conjugating enzymes)和 E3 泛素连接酶(ubiquitin-ligase enzymes)。

目前已发现的泛素结合酶 E2 约 40余种，E3 泛素连接酶>500种。

每个连接酶将泛素转移至特定蛋白质靶标。

图2 泛素化修饰过程[2]
4
质谱鉴定泛素化修饰蛋白的原理
1）胰蛋白酶在泛素 C 末端切割泛素，在靶蛋白的赖氨酸残基上留下泛素衍生的二甘氨酸残基。

2）含有泛素残余的肽用二甘氨酰—赖氨酸(K-E-GG) 特异性抗体纯化。

3）质谱法用于测序这些肽并鉴定修饰的赖氨酸残基。

但是，不能区分单泛素化与多聚泛素化。

图3 质谱检测原理[3] 5
泛素化修饰的生物学功能
泛素化修饰在细胞生命周期各个方面，通过对蛋白质稳定性、定位、活性以及相互作用的调控，广泛参与了诸如转录调节、DNA 损伤修复、细胞周期、细胞凋亡、囊泡运输等生理过程。

泛素-蛋白酶体降解途径(ubiquitin-pro-teasomepathway, UPP) 介导了真核生物体内80%~85%的蛋白质降解，UPP 主要在两个阶段起作用，①新合成蛋白的质控，若是新合成的蛋白质存在错误折叠等原因，立刻进行降解；
②蛋白行使完功能后的降解再循环利用。

泛素化作为一种基础修饰类型，参与了几乎所有生命过程，其功能研究涉及各个研究领域，下面就几个研究比较多的方向进行简单总结。

1）细胞的增殖、分化细胞增殖和分化是重要的细胞生命活动，是生物遗传、发育和演化的基础。

研究细胞增殖与分化，不仅对认识生命具有十分重要的理论意义，也为矫正生命现象的紊乱，如相关疾病的治疗等，提供重要的理论依据。

泛素化修饰在细胞系功能研发方向应用广泛。

例如，CKIP-1（先磷酸化后泛素化）通过抑制TRAF6 介导的Akt 活化来调节巨噬细胞增殖（2014；Cell Res；17.848；PMID:24777252）。

2）癌症、肿瘤发生
在癌症中，泛素-蛋白酶体通路紊乱可通过各种方式导致肿瘤形成。

E3（500余种）有的是致癌因子，有的是抑癌因子，还有的可在特定条件下互相转换，编码 E3 泛素连接酶的 von Hippel Lindau vhl 基因，其突变是嗜铬细胞瘤（PCC）的根本原因；去泛素化酶DUB（100余种）在细胞周期进程中的作用同样很重要，DUB 功能失调常在肿瘤中发现，此外在膀胱癌、神经胶质瘤等肿瘤中均发现了 DUB 的过表达。

蛋白修饰研究有利于我们全方位多角度的揭示病理，比如明星基因p53，抑癌基因p53 的失活一方面是由基因突变造成的，另一方面也可能由于 p53 的异常降解引起。

3）神经性退行性疾病
神经元特别容易受到蛋白质组成的任何变化的影响，因此泛素—蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system, UPS）是神经元生物学的关键调节因子。

蛋白质泛素化和去泛素化是调节神经元发育、突
触可塑性、学习和记忆的重要翻译后修饰。

因此，泛素化修饰在神经退行性疾病中研究广泛。

例如，编码 E3 泛素连接酶的 parkin 基因和编码泛素C-末端水解酶（UCH-L1）的uchl1 基因的突变与早发性常染色体隐性遗传形式的帕金森病相关（2011；Physiol Rev. ；24.25；PMID:22013209）。

4）非生物胁迫、功能基因挖掘、植物发育
胁迫条件下，一方面，UPP 可以通过转录因子进行基因表达调控，积极应对胁迫；另一方面，UPP 可以通过降解因胁迫积累的错误折叠蛋白以减轻这些毒性蛋白造成的植物伤害。

植物领域的泛素化研究，对于重要功能基因发掘与作物分子遗传改良、植物抗逆、植物发育具有重要的应用价值。

非洲稻高温抗性的功能基因OgTT1，其编码的蛋白使细胞中的蛋白酶体在高温下对泛素化底物的降解速率更快以抵御高温胁迫（2015；Nat Genet.；25.455；PMID: 25985140）。

5）细胞器发育相关的生物学现象
细胞器蛋白质组变化与质体从一种形式转变为另一种形式的发育阶段密切相关。

泛素—蛋白酶体系统作用于细胞质体以控制它们的发育。

已有研究发现，细胞核编码的蛋白要进入细胞器发挥作用，进入细胞器的阀门，受泛素化调控，进而通过叶绿体，进而影响光合作用，果实成熟，黄化幼苗等生命进程。

例如，叶绿体的生物发生受泛素-蛋白酶体系统的直接作用调节（2012；Science；41.037；PMID: 23118188）。