分离工程第二章,细胞分离与破碎

4.1.4 干燥法
• 经干燥后的细胞，其细胞膜的渗透性发生变化， 同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇 或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提 出来。
4.2 非机械法
• 非机械方法很多 ⑴酶解 ⑵渗透压冲击 ⑶冻结和融化 ⑷干燥法 ⑸化学法溶胞 • 其中酶法和化学法溶胞应用最广
4.2.1 酶解
随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展， 以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。
2.2 细胞破碎
2、目标产物的定位
胞外
一些微生物在代谢过程中将产物分泌到细胞之 外的液相中（称胞外酶），这些产品主要为医药 和保健产品，如胰岛素、某些细胞因子和疫苗亚 单位成分等。
这些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到 培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进 行固－液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步 纯化即可。其后续分离和纯化都相对简单。
半乳糖醛酸聚糖 、 鼠李半乳糖醛酸聚糖
果胶物质 半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖
蛋白质 结构蛋白 各种酶类
凝集素
• 目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同 用途和不同类型的细胞壁破碎。
• 破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。
4. 细胞破碎方法分类
破碎方式
机械法
非机械法
固体剪切 作用
液体剪切
干燥
作用
• 其中 R — 破碎率；
•
K一 一级反应速度常数；
•
t一 时间。
• 一级反应速度常数K与许多操作参数有关，如 如搅拌转速、细胞悬浮液的浓度和循环速度、 玻璃小珠的装量和珠体的直径，以及温度等。
瑞士Ｄyno珠磨机
• 高速珠磨机（High speed bead mill）
• 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻 璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅 拌，使细胞获得破碎。在工业规模的破碎中， 常采用高速珠磨机 。
• 概述
• 对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次 生壁两部分。
• 初生壁是细胞生长期形成的。
• 次生壁是细胞停止生长后，在初生壁内部形成的 结构。
植物细胞初生壁的化学组成
组分
结构和分类
纤维素 β－1，4－D－葡聚糖
半纤维素
木葡聚糖 甘露聚糖 木聚糖(包括阿拉伯 木聚糖和4-0-甲基-葡萄糖醛酸木聚糖）
浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。
为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节 温度，使出口温度调节在20℃左右。在工业规模的 细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于 生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。
标准阀
细胞破碎阀
锯齿阀
刀型阀
锥型阀 球型细胞破碎阀
高压匀浆器各种阀型设计
高压匀浆法适用的范围
与细菌细胞壁一样，破碎酵母细胞壁的阻力 主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。
红面包霉菌(Neurospora crassa)的 细胞壁结构示意图
红面包霉菌细胞壁的结构示意图
• 主要存在三种聚合物，葡聚糖（主要以β1,3 糖 苷 键 连 接 ， 某 些 以 β-1,6 糖 苷 键 连
• 概接蛋述）白，。几最丁外质层（(a以)是微α纤-维和状β态-葡存聚在糖）的以混及糖合
高压匀浆器的种类
高压匀浆器的种类较多 WAB公司的AVP Gaulin 31MR型
最大操作压力为24MPa 最大处理量为为100dm3/h
Bran and luebbe 公司SHL40型 最大操作压力为20-63MPa 最大处理量为为2.6-34 m3/h
细胞破碎分率关系式
破碎属于一级反应速度过程，被破碎的细胞分率 符合如下公式： ln[1/(1-R)]=KNPɑ
• 2.1.3过滤 • 恒压过滤 公式2.33 • 恒速过滤 公式2.36
2.2 细胞破碎
1. 概念
细胞破碎（cell rupture）：技术是指利用外力 破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成 分释放出来的技术。
细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生 化物质（产品）的基础。(图1.1）
4.1.1 高压匀浆器（High pressure homogenizer）
阀座
阀杆 撞击环 阀杆
压力控制手轮
APV Manton Gaulin 高压匀浆器针型阀结构简图
操作原理
细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫 使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上， 由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪 切力而破碎。在操作方式上，可以采用单次通过匀
Brokman等人已研究了能适应于高压操作的匀浆 阀，试验表明在约175 MPa的压力下，破碎率可达 100％，但是也有试验表明当压力超过一定的值后， 破碎率增长得很慢，在工业生产中，通常采用的压 力为55－70Mpa。
破碎作用方程
• 破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程， 符合下列公式：
•
ln[1/(1-R)]=Kt
超声波破碎的机理
• 一般认为在超声波作用下液体发生空化作用 （ cavitation),空穴的形成、增大和闭合产 生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。超声 波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波 的声频、声能有关。
超声波破碎的适用范围
• 超声波碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微 生物的破碎。
• 超声波破碎的有效能量利用率极低，操作过程产 生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容 器中进行。由于对冷却的要求相当苛刻，所以不 易放大，主要用于实验室规模的细胞破碎。
4.1.3 渗透压冲击法
• 渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞 放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或 蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分 便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后， 将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中， 由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞 内，引起细胞快速膨胀而破裂。
• 一般来说哪一种细菌容易破壁？
酵母细胞壁的结构示意图
破碎酵母细胞壁的阻力
酵母细胞壁的结构示意图如图15－2所示， 细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它 构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的 形状，覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白，最 外层是甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯键共价连 接，形成网状结构。在该层的内部，有甘露聚 糖-酶的复合物，它可以共价连接到网状结构 上，也可以不连接。
• 大概不述同。
• 革兰氏阴性菌比阳性菌复杂，在电子显微镜超薄切 片观察，可见革兰氏阳性菌细胞壁较厚，具有20～ 80nm的肽聚糖层，约占细胞壁成分的40～90％，此 外细胞壁还含有大量磷壁酸(eichoic acid)。
• 而革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄，仅2～3nm，占细 胞壁成分的10％左右，由于肽聚糖之间仅由四肽侧 链直接连接，缺乏五肽桥，故层较疏松，而且肽聚 糖居于细胞壁最内层，紧贴在细胞膜上。
举例：几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物
药物名称 胰岛素
宿主 大肠杆菌
用途 治疗糖尿病
人生长激素（HGH） 大肠杆菌
α-干扰素
大肠杆菌
治疗侏儒病
治疗毛状细胞 白血病和卡波 济肉瘤
3、细胞结构（微生物、生物化学；细菌、酵母、植物 细胞）
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁 里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称原 生质体。
• 超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波 振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞 悬浮液。
• 超声波振荡器有不同的类型，常用的为电声型， 它是由发生器和换能器组成，发生器能产生高 频电流，换能器的作用是把电磁振荡转换成机 械振动。
• 超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介 质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。
高压匀浆法适用的范围： 酵母和大多数细菌细胞的破碎。 料液细胞浓度可达到20%左右。 ☆团状和系状菌易造成高压匀浆器的堵塞，不宜
使用高压匀浆法。
高压匀浆法使用时注意事项
高压匀浆器的操作温度上升约２－３℃/10MPa 为了保护目标产物的生物活性，需要对料液作冷
却处理。
多组破碎操作中需要在级间设置冷却装置可有效 防止温度上升，保护产物活性。
•÷
★ 胞内
一些重组DNA（rDNA）产品结构复杂，必 须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养 时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往 往有所改变，此类rDNA产品是细胞内产品（非 分泌型），需要应用细胞破碎技术破碎细胞， 使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯， 为后续的分离纯化做好准备工作。
动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常细胞壁 较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因 此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。
基于遗传和环境等因素，不同类生化物质其细胞 壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度 不同，细胞破碎的难易程度也就不同。此外，不同 的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应 防止变性和被胞内的酶水解，因此，破碎方法的选 择和操作条件的优化是十分必要的。
• 酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞 壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方 法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。
• 溶菌酶（lysozyme)适用于革兰氏阳性菌细胞的分 解，应用于革兰氏阴性菌时，需辅以EDTA使之更有 效地作用于细胞壁。
• 真核细胞的细胞壁不同于原核细胞，需采用不同的 酶。
酵母菌的细胞结构
5 细胞核 1 细胞壁 2 细胞膜 3 细胞质 4 液泡
细菌的细胞结构
真核细胞
细胞核 核仁
糙面内质网
光面内质网
线粒体
中心粒
溶酶体
线粒体
颗粒 嵴
核糖体
• 概述
细胞膜的结构
细胞壁的组成和结构（细菌肽聚糖结构示 意图）
几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖 （peptidoglycan）组成，它是难溶性的聚糖
物，第2层(b)是糖蛋白的网状结构，葡聚糖 与糖蛋白结合起来，第3层(c)主要是蛋白质， 最内层(d)主要是几丁质，几丁质的微纤维 嵌入蛋白质结构中。
• 与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的 强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此， 它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所 以强度有所提高。
植物细胞壁的化学组成和结构
处理
溶胞 作用
珠磨法 压榨 高 压 匀 浆
超 酶溶法 声 破 碎
化学法 物理法
4.1 机械法
高压匀浆破碎法（homogenization） 高速搅拌珠研磨破碎法（fine grinding） 超声波破碎法（ultrasonication）
4.2 非机械法破碎方法
渗透压冲击破碎法（osmotic shock） 冻融破碎法（freezing and thawing） 酶溶破碎法（enzyme lysis） 化学破碎法（chemical treatment） 去垢剂破碎法（detergents）
Ｄyno珠磨机
德国Netzsch LM-20型珠磨机
LM-20型珠磨机
• 园盘以两种位置交错地安装在轴上，一种处于 径向，一种和轴倾斜，径向园盘使磨料沿径向 运动，倾斜园盘则产生轴向运动。
• 由于交错的运动，提高了破碎效率。除磨室有 冷却夹套外，搅拌轴和园盘也可以冷却。
4.1.2 超声波破碎
• 概链述（glycan chain），借助短肽交联而成的网
状结构，包围在细胞周围，使细胞具有一定的 形状和强度。
短肽一般由四或五个氨基酸组成，如L-
丙氨酰-D-谷氨酰-L-赖氨酰-D-丙氨酸。而且
短肽中常有D-氨基酸与二氨基庚二酸存在。
• 虽然几乎所有的细菌都含有肽聚糖的网状结构，但 是革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很
生物分离工程
swflgc@
第二章 细胞分离与破碎 2.1 细胞分离（简介）
• 2.1.1 重力沉降： Stokes定律 ，式2.6 • 2.1.2 离心沉降： 和重力沉降的联系 • 差速离心分级（图2.1） • 区带离心：差速区带离心和平衡区带离心，
前者最大密度小于待分离的目标产物的密度 • 管式离心机 公式2.23和2.23（a）
式中 R — 破碎率，为N次循环后，蛋白质的 释放量Rn与最大释放量Rm之比； K － 与温度有关的速度常数； N － 悬浮液通过匀浆器的次数； P － 操作压力，MPa； ɑ－ 与微生物种类有关的常数。
影响破碎的主要因素
压力 温度 通过均浆器阀的次数
高压匀浆器破碎细胞
升高压力有利于破碎，它表明可以减少细胞的 循环次数，在不明显增加通过量的情况下，甚至一 次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可 避免细胞碎片不至过小，从而给随后细胞碎片的分 离工作带来好处。