RNA的转录
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• 大多为重复序列，一般长约50bp，适合与某些蛋白因 子结合。其内部常含有一个核心序列：（G） TGGA/TA/TA/T（G），是产生增强效应时所必需的；
• 增强效应有严密的组织和细胞特异性，说明只有特定 的蛋白质（转录因子）参与才能发挥其功能；
• 没有基因专一性，可以在不同的基因组合上表现增强 效应；
m7GpppXmpYmp---------- (with Cap-2)
SAM: S - 腺苷基 - L - 甲硫氨酸 SAH: S - 腺苷基 - L – 同型半胱氨酸
帽子结构的功能
• 1）有助于mRNA越过核膜，进入胞质； • 2）保护5’端不被核酸酶降解； • 3）翻译时供IF III (起始因子) 和核糖体识别。
• 在σ因子的辅助下，RNA聚合酶首先与-35区结合，由 于RNA聚合酶能覆盖60-70个bp的DNA序列，因此酶分 子的某个区域能到达-10区域，并随即与其结合；
• 三种因素控制启动子的强度：
• -35区与RNA聚合酶的亲和性； • -10区的碱基可以影响开放启动子复合物的形成速率； • -10区与-35区之间的距离决定了启动子的效率，17bp是最佳间
4.4.2 RNA聚合酶Ⅲ
• 分为两类
• 转录5S RNA的启动子：A区（+50 - +60）与C区（ +80 - +90 ）；
• 转录tRNA启动子：A区与B区
• 转录需要共同转录因子的作用：TFⅢA、B、C；
4.5 转录的起始与延伸
σ亚基发现启动子区域
全酶与-35区结合
全酶向-10区转移并牢固结合
4.3 原核生物的启动子结构
DNA
promoter
Transcribed region terminator
ATACG
TATGC
Antisense strand
Transcription
RNA AUACG
以大肠杆菌乳糖操纵子为例
➢ 把开始转录的第一个碱基定义为+1，因此启动子区域 为负数标志；
➢ 启动子区域一般包括40-60bp; ➢ -55 to +20：与RNA聚合酶结合； ➢ -20 to +20：与RNA聚合酶紧密结合，可以避免
4.2.1 E. coli RNA聚合酶
155 KD
36.5 KD
11 KD 36.5 KD
151 KD
70 KD
仅与起始相关
与起始和延伸相关
40 nt/sec
β 亚基
• 由rpoB基因编码； • RNA合成的催化中心； • 利福平（ Rifampicin ）能结合该亚基，从而抑制RNA
转录; • β 亚基也许包含两个domain，分别负责RNA转录的起
The cap binding protein complex (CBC) binds the cap: this is needed when the mRNA is exported from the nucleus.
4.7.2 尾巴
• poly-A tail is added in two main steps:
DNAase Ⅰ的消化； ➢ +1 to -40：对启动子的功能是非常关键的； ➢ -10 & -35区域：是非常关键的启动子区域。
TTGACA---16-18 bp---
TATAAT
---5-8 bp---
CAT G
-35 sequence
-10 sequence
4.3.1 -10区 (Pribonow box)
• 当然发卡结构后的序列也要求有比较低的接合能力， 如果低到一个更低的数值，该终止子也就成为不依赖 ρ 因子的终止子了。
4.6.3 无义突变的极性效应
• 在翻译比较旺盛时，原核细胞转录和翻译同时进行， 由于核糖体挡道，ρ因子很难追上RNA聚合酶。因此在 一个操纵子中，前一个基因内部的无义突变可使ρ因子 追上RNA聚合酶，使得后随基因表达受阻。
-10区与起始位点之间局部解链(12-17bp)， 开放性启动子复合物形成
RNA聚合酶被核苷酸前体充满
β 亚基催化形成第一个磷酸二酯键
σ亚基开始脱落，使RNA聚合酶与DNA链的结合处 于非特异性状态，便于RNA聚合酶在链上的滑动
转录终止
新生成的RNA链与模板DNA形成的杂和链非 常短，估计在2-10个碱基左右，而DNA复制时 的RNA引物可达50-60bp，Why?
SAM
RNA鸟嘌呤-7-甲基转移酶
SAH
m7GpppXpYp---------- -(with Cap-0)
m7
GpppXpYp-------------
SAM
RNA 核苷-2’-O-甲基转移酶
SAH
m7GpppXmpYp---------- (with Cap-1)
SAM SAH
RNA 核苷-2’-O-甲基转移酶
4.6.3 Rho因子的终止原理
• ρ因子是六聚体，具有NTPase酶活性（只有RNA链长 超过50时才具有）；
• ρ因子一般认为从RNA的5’端结合上去，也有学者认为 存在特定的结合区域；
• ρ因子沿着转录出的RNA移动要比RNA聚合酶延DNA 移动快。当RNA 聚合酶达到终止子时就暂停下来，那 么在此位置ρ就会追上RNA聚合酶。 ρ因子可通过与 RNA聚合酶β 亚基的直接作用，使RNA聚合酶从转录 复合体脱落下来；
• 长度6 bp，分布在位置-10的两侧； • 保守序列为：TATAAT，TATPuAT更加合适； • 前两个碱基和最后一个碱基在大肠杆菌所有的基因中
都是极其保守的：T80A95T45A60A50T96; • 这个六聚体距离+1大概5-8bp，这个距离对于启动子的
活性是非常关键的。
4.3.2 -35区 (Sextama box)
After 30 ±nt transcription，pre-RNA capping starts
5’ pppXpY---------------------(30 Nt)-3’ (pre--RNA)
pi
核苷磷酸水解酶
ppXpY-----
GTP ppi
RNA鸟苷转移酶（加帽酶）
GpppXpYp-----------
距。
4.3.3 CAP位点
• 当体系中同时存在葡萄糖和乳糖的时候，大肠杆菌对 乳糖是不理睬的，这是为什么呢？
• 当细胞缺少葡萄糖时，腺苷酸环化酶将ATP环化为 cAMP，后者与其受体蛋白CAP结合，这个复合物再与 启动子上的CAP位点结合，只有这样，乳糖启动子才 能与RNA聚合酶结合，起始转录。当有葡萄糖存在时 ， cAMP无法形成……
4.2.2 真核 RNA聚合酶
➢ 包含三种RNA聚合酶
• RNA Pol Ⅰ 存在核仁中，转录r RNA （5.8S、18S、28S）; • RNA Pol Ⅱ 存在核质中，转录m RNA与sn RNA （核内小RNA）; • RNA Pol Ⅲ 存在核质中，转录t RNA与5S RNA。
➢ 三种RNA聚合酶的大小均在500KDa，包含两个大亚基 和4-8个小亚基。
➢ 本节介绍RNA Pol Ⅱ与RNA Pol Ⅲ
4.4.1 RNA聚合酶Ⅱ
• 启动子具有四个保守部分，前三个一般都具备：
• 帽子位点 转录起始位点，碱基多为A，两侧为若干嘧啶，这与原核生物的
“ CAT”规律一致； • TATA框 -25位置附近，与原核Pribnow框的作用一致，序列的保守性为：
4.1 RNA合成的基本特征
➢ 以核糖核苷三磷酸（rNTR）为底物； ➢ 碱基为：A、U、C、G ➢ 以DNA为模板； ➢ 按5′-3′方向合成； ➢ 在体内DNA双链中仅一条链作为模板; ➢ RNA的序列和模板是互补的; ➢ 转录时DNA-RNA杂合双链分子是不稳定的，RNA链很
快被游离的DNA所取代，DNA又恢复双链状态。
4.6 转录的终止
➢号的这段DNA 序列称为终止子。
➢ 主要特征
• 转录终止点前有一段回文序列，能形成茎环或发卡结构
➢ 转录终止子有两种类型：
• 不依赖ρ因子 具有茎环或发卡结构，多聚U尾巴 • 依赖ρ因子 具有茎环或发卡结构，需要Rho因子辅助
• 真核生物通过一系列的反应在5’端加上了帽子，不同 的真核生物有不同的帽子结构：
Cap-0
m7GpppXpYp------- (单核真核)
Cap-1
m7GpppXmpYp-------（高等真核）
Cap-2
m7GpppXmpYmp------- （10-15%高等真核的mRNA）
mRNA capping proceeding
T82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37）； • CAAT框 -75位置附近，一致序列为GGC（T）CAATCT，控制转录起始
效率； • 增强子 远上游序列。
增强子
• 有效的增强子可以位于基因的5’端，也可位于基因的3’ 端，有的还可位于基因的内含子中 ；
• 增强效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10200倍；
• CAP-cAMP复合物的结合，使得CAP2附近的G:C稳定 性降低，使得RNA聚合酶能顺利解开DNA双链，起始 转录；
• 如果把-10区的碱基序列从TATGAT突变成TATAAT， 细胞将能同时利用葡萄糖和乳糖。
4.4 真核生物的启动子结构
➢ 三种聚合酶有多种不同的启动子；
• RNA Pol Ⅰ 转录r RNA （5.8S、18S、28S），仅包含一种类型启动子; • RNA Pol Ⅱ 转录m RNA与sn RNA，启动子非常复杂; • RNA Pol Ⅲ 转录t RNA与5S RNA，启动子位于转录区域内。
• 乳糖操纵子存在两个CAP位点
• -70 to -50：具有一个反向重复序列 • -50 to -40：位点1的结合促进了位点2的结合
CAP
CAP σ
RNA聚合酶
-60
-45
-35
-10 TATGTT
• 乳糖操纵子的-10区碱基序列为TATGTT，由于中心存 在G:C碱基对。使得RNA聚合酶无法解开双链进行转 录起始；
4.6.1茎环或发卡
5‘ NNNNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUUUUUU -OH
N NN NC G•C C•G C•G G•C C•G G•C A•U A•U … NNNN UUUU-OH
4.6.1 终止原理
发卡结构形成以后，会与RNA聚合酶以某种特定的结 构嵌合，使RNA聚合酶会出现一定时间的延滞，这是 如果发卡结构后面的RNA序列为寡聚的U或A，杂和双 链由于结合力比较若，就会发生分离，如果没有这样 的多聚U/A结构，则需要Rho蛋白来辅助终止。
始和延伸。
σ 亚基
• 由rpoD基因编码；大肠杆菌编码几个σ因子，此处的σ 因子称为σ70；
• 决定RNA聚合酶在启动子区域正确起始，如果没有σ因 子，RNA的转录将可以在任一DNA模板区域起始；
• 当正确起始，RNA链延伸到8-9nt时， σ因子脱落。
知识点补充 20种氨基酸的平均分子量为138道尔顿，小分子氨基酸出现 的频率较大因此加权平均分子量为128，在此基础上减去一 分子被脱去的水分子量，即128-18=110。所以“氨基酸残基 ”的平均分子量通常按110计算。
• 在 –35位置附近的一个保守的六聚体； • 保守序列为 T82T84G78A65C54A45， • 在大肠杆菌所有的启动子中，前三个碱基(TTG)是非常
保守的； • 在90%的启动子中，-35区与-10区的距离一般保持在
16-18bp之间。
大肠杆菌中不同 基因启动子序列 比较
-10区与-35区控制转录强度
4.2 RNA合成的酶学
➢ 聚合的过程中不需要引物； ➢ 需要双链的DNA作为起始的模板； ➢ Mg2+对RNA聚合酶的活力是必需的； ➢ 所有的RNA聚合酶没有3’-5’的外切活性，具有10-5-10-4
左右的出错率； ➢ 通常是多亚基结构，但也有单亚基的情况，例如噬菌
体T3、T7的RNA聚合酶是单肽，而且移动速度为200 nt/sec。
1. 在切割位点前13-20bp的位置存在AAUAAA序列，可 被 切割及多聚腺苷化特异因子（cleavage and polyadenylation specificity factor ，CPSF）识别结合, 后者促进切割核酸内切酶 CStF 切割 CA 位点，在切 割位点后还存在保守序列GUGUGUG ；
4.7 转录后处理
pre-RNA
capping tailing splicing methylation Etc.
mature RNA
4.7.1 帽子
• 真核生物的转录起始位点可以是pppA或者pppG，但真 实的情况却总是N7甲基鸟苷酸打头，并且通过5’-5’磷 酸二酯键与下一个核苷酸连接，why?；
• 增强效应有严密的组织和细胞特异性，说明只有特定 的蛋白质（转录因子）参与才能发挥其功能；
• 没有基因专一性，可以在不同的基因组合上表现增强 效应；
m7GpppXmpYmp---------- (with Cap-2)
SAM: S - 腺苷基 - L - 甲硫氨酸 SAH: S - 腺苷基 - L – 同型半胱氨酸
帽子结构的功能
• 1）有助于mRNA越过核膜，进入胞质； • 2）保护5’端不被核酸酶降解； • 3）翻译时供IF III (起始因子) 和核糖体识别。
• 在σ因子的辅助下，RNA聚合酶首先与-35区结合，由 于RNA聚合酶能覆盖60-70个bp的DNA序列，因此酶分 子的某个区域能到达-10区域，并随即与其结合；
• 三种因素控制启动子的强度：
• -35区与RNA聚合酶的亲和性； • -10区的碱基可以影响开放启动子复合物的形成速率； • -10区与-35区之间的距离决定了启动子的效率，17bp是最佳间
4.4.2 RNA聚合酶Ⅲ
• 分为两类
• 转录5S RNA的启动子：A区（+50 - +60）与C区（ +80 - +90 ）；
• 转录tRNA启动子：A区与B区
• 转录需要共同转录因子的作用：TFⅢA、B、C；
4.5 转录的起始与延伸
σ亚基发现启动子区域
全酶与-35区结合
全酶向-10区转移并牢固结合
4.3 原核生物的启动子结构
DNA
promoter
Transcribed region terminator
ATACG
TATGC
Antisense strand
Transcription
RNA AUACG
以大肠杆菌乳糖操纵子为例
➢ 把开始转录的第一个碱基定义为+1，因此启动子区域 为负数标志；
➢ 启动子区域一般包括40-60bp; ➢ -55 to +20：与RNA聚合酶结合； ➢ -20 to +20：与RNA聚合酶紧密结合，可以避免
4.2.1 E. coli RNA聚合酶
155 KD
36.5 KD
11 KD 36.5 KD
151 KD
70 KD
仅与起始相关
与起始和延伸相关
40 nt/sec
β 亚基
• 由rpoB基因编码； • RNA合成的催化中心； • 利福平（ Rifampicin ）能结合该亚基，从而抑制RNA
转录; • β 亚基也许包含两个domain，分别负责RNA转录的起
The cap binding protein complex (CBC) binds the cap: this is needed when the mRNA is exported from the nucleus.
4.7.2 尾巴
• poly-A tail is added in two main steps:
DNAase Ⅰ的消化； ➢ +1 to -40：对启动子的功能是非常关键的； ➢ -10 & -35区域：是非常关键的启动子区域。
TTGACA---16-18 bp---
TATAAT
---5-8 bp---
CAT G
-35 sequence
-10 sequence
4.3.1 -10区 (Pribonow box)
• 当然发卡结构后的序列也要求有比较低的接合能力， 如果低到一个更低的数值，该终止子也就成为不依赖 ρ 因子的终止子了。
4.6.3 无义突变的极性效应
• 在翻译比较旺盛时，原核细胞转录和翻译同时进行， 由于核糖体挡道，ρ因子很难追上RNA聚合酶。因此在 一个操纵子中，前一个基因内部的无义突变可使ρ因子 追上RNA聚合酶，使得后随基因表达受阻。
-10区与起始位点之间局部解链(12-17bp)， 开放性启动子复合物形成
RNA聚合酶被核苷酸前体充满
β 亚基催化形成第一个磷酸二酯键
σ亚基开始脱落，使RNA聚合酶与DNA链的结合处 于非特异性状态，便于RNA聚合酶在链上的滑动
转录终止
新生成的RNA链与模板DNA形成的杂和链非 常短，估计在2-10个碱基左右，而DNA复制时 的RNA引物可达50-60bp，Why?
SAM
RNA鸟嘌呤-7-甲基转移酶
SAH
m7GpppXpYp---------- -(with Cap-0)
m7
GpppXpYp-------------
SAM
RNA 核苷-2’-O-甲基转移酶
SAH
m7GpppXmpYp---------- (with Cap-1)
SAM SAH
RNA 核苷-2’-O-甲基转移酶
4.6.3 Rho因子的终止原理
• ρ因子是六聚体，具有NTPase酶活性（只有RNA链长 超过50时才具有）；
• ρ因子一般认为从RNA的5’端结合上去，也有学者认为 存在特定的结合区域；
• ρ因子沿着转录出的RNA移动要比RNA聚合酶延DNA 移动快。当RNA 聚合酶达到终止子时就暂停下来，那 么在此位置ρ就会追上RNA聚合酶。 ρ因子可通过与 RNA聚合酶β 亚基的直接作用，使RNA聚合酶从转录 复合体脱落下来；
• 长度6 bp，分布在位置-10的两侧； • 保守序列为：TATAAT，TATPuAT更加合适； • 前两个碱基和最后一个碱基在大肠杆菌所有的基因中
都是极其保守的：T80A95T45A60A50T96; • 这个六聚体距离+1大概5-8bp，这个距离对于启动子的
活性是非常关键的。
4.3.2 -35区 (Sextama box)
After 30 ±nt transcription，pre-RNA capping starts
5’ pppXpY---------------------(30 Nt)-3’ (pre--RNA)
pi
核苷磷酸水解酶
ppXpY-----
GTP ppi
RNA鸟苷转移酶（加帽酶）
GpppXpYp-----------
距。
4.3.3 CAP位点
• 当体系中同时存在葡萄糖和乳糖的时候，大肠杆菌对 乳糖是不理睬的，这是为什么呢？
• 当细胞缺少葡萄糖时，腺苷酸环化酶将ATP环化为 cAMP，后者与其受体蛋白CAP结合，这个复合物再与 启动子上的CAP位点结合，只有这样，乳糖启动子才 能与RNA聚合酶结合，起始转录。当有葡萄糖存在时 ， cAMP无法形成……
4.2.2 真核 RNA聚合酶
➢ 包含三种RNA聚合酶
• RNA Pol Ⅰ 存在核仁中，转录r RNA （5.8S、18S、28S）; • RNA Pol Ⅱ 存在核质中，转录m RNA与sn RNA （核内小RNA）; • RNA Pol Ⅲ 存在核质中，转录t RNA与5S RNA。
➢ 三种RNA聚合酶的大小均在500KDa，包含两个大亚基 和4-8个小亚基。
➢ 本节介绍RNA Pol Ⅱ与RNA Pol Ⅲ
4.4.1 RNA聚合酶Ⅱ
• 启动子具有四个保守部分，前三个一般都具备：
• 帽子位点 转录起始位点，碱基多为A，两侧为若干嘧啶，这与原核生物的
“ CAT”规律一致； • TATA框 -25位置附近，与原核Pribnow框的作用一致，序列的保守性为：
4.1 RNA合成的基本特征
➢ 以核糖核苷三磷酸（rNTR）为底物； ➢ 碱基为：A、U、C、G ➢ 以DNA为模板； ➢ 按5′-3′方向合成； ➢ 在体内DNA双链中仅一条链作为模板; ➢ RNA的序列和模板是互补的; ➢ 转录时DNA-RNA杂合双链分子是不稳定的，RNA链很
快被游离的DNA所取代，DNA又恢复双链状态。
4.6 转录的终止
➢号的这段DNA 序列称为终止子。
➢ 主要特征
• 转录终止点前有一段回文序列，能形成茎环或发卡结构
➢ 转录终止子有两种类型：
• 不依赖ρ因子 具有茎环或发卡结构，多聚U尾巴 • 依赖ρ因子 具有茎环或发卡结构，需要Rho因子辅助
• 真核生物通过一系列的反应在5’端加上了帽子，不同 的真核生物有不同的帽子结构：
Cap-0
m7GpppXpYp------- (单核真核)
Cap-1
m7GpppXmpYp-------（高等真核）
Cap-2
m7GpppXmpYmp------- （10-15%高等真核的mRNA）
mRNA capping proceeding
T82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37）； • CAAT框 -75位置附近，一致序列为GGC（T）CAATCT，控制转录起始
效率； • 增强子 远上游序列。
增强子
• 有效的增强子可以位于基因的5’端，也可位于基因的3’ 端，有的还可位于基因的内含子中 ；
• 增强效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10200倍；
• CAP-cAMP复合物的结合，使得CAP2附近的G:C稳定 性降低，使得RNA聚合酶能顺利解开DNA双链，起始 转录；
• 如果把-10区的碱基序列从TATGAT突变成TATAAT， 细胞将能同时利用葡萄糖和乳糖。
4.4 真核生物的启动子结构
➢ 三种聚合酶有多种不同的启动子；
• RNA Pol Ⅰ 转录r RNA （5.8S、18S、28S），仅包含一种类型启动子; • RNA Pol Ⅱ 转录m RNA与sn RNA，启动子非常复杂; • RNA Pol Ⅲ 转录t RNA与5S RNA，启动子位于转录区域内。
• 乳糖操纵子存在两个CAP位点
• -70 to -50：具有一个反向重复序列 • -50 to -40：位点1的结合促进了位点2的结合
CAP
CAP σ
RNA聚合酶
-60
-45
-35
-10 TATGTT
• 乳糖操纵子的-10区碱基序列为TATGTT，由于中心存 在G:C碱基对。使得RNA聚合酶无法解开双链进行转 录起始；
4.6.1茎环或发卡
5‘ NNNNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUUUUUU -OH
N NN NC G•C C•G C•G G•C C•G G•C A•U A•U … NNNN UUUU-OH
4.6.1 终止原理
发卡结构形成以后，会与RNA聚合酶以某种特定的结 构嵌合，使RNA聚合酶会出现一定时间的延滞，这是 如果发卡结构后面的RNA序列为寡聚的U或A，杂和双 链由于结合力比较若，就会发生分离，如果没有这样 的多聚U/A结构，则需要Rho蛋白来辅助终止。
始和延伸。
σ 亚基
• 由rpoD基因编码；大肠杆菌编码几个σ因子，此处的σ 因子称为σ70；
• 决定RNA聚合酶在启动子区域正确起始，如果没有σ因 子，RNA的转录将可以在任一DNA模板区域起始；
• 当正确起始，RNA链延伸到8-9nt时， σ因子脱落。
知识点补充 20种氨基酸的平均分子量为138道尔顿，小分子氨基酸出现 的频率较大因此加权平均分子量为128，在此基础上减去一 分子被脱去的水分子量，即128-18=110。所以“氨基酸残基 ”的平均分子量通常按110计算。
• 在 –35位置附近的一个保守的六聚体； • 保守序列为 T82T84G78A65C54A45， • 在大肠杆菌所有的启动子中，前三个碱基(TTG)是非常
保守的； • 在90%的启动子中，-35区与-10区的距离一般保持在
16-18bp之间。
大肠杆菌中不同 基因启动子序列 比较
-10区与-35区控制转录强度
4.2 RNA合成的酶学
➢ 聚合的过程中不需要引物； ➢ 需要双链的DNA作为起始的模板； ➢ Mg2+对RNA聚合酶的活力是必需的； ➢ 所有的RNA聚合酶没有3’-5’的外切活性，具有10-5-10-4
左右的出错率； ➢ 通常是多亚基结构，但也有单亚基的情况，例如噬菌
体T3、T7的RNA聚合酶是单肽，而且移动速度为200 nt/sec。
1. 在切割位点前13-20bp的位置存在AAUAAA序列，可 被 切割及多聚腺苷化特异因子（cleavage and polyadenylation specificity factor ，CPSF）识别结合, 后者促进切割核酸内切酶 CStF 切割 CA 位点，在切 割位点后还存在保守序列GUGUGUG ；
4.7 转录后处理
pre-RNA
capping tailing splicing methylation Etc.
mature RNA
4.7.1 帽子
• 真核生物的转录起始位点可以是pppA或者pppG，但真 实的情况却总是N7甲基鸟苷酸打头，并且通过5’-5’磷 酸二酯键与下一个核苷酸连接，why?；