生化实验PPT3

3. 加样15 ul / 样品槽（注意样品编号，加样顺序）； 接冷却管（流速要小）；
4. 电泳：起始电流10 mA/板，分离电流20 mA/板， 电泳4 hr；
5. 染色和制干板 1）剥胶，右上角切一角作标记； 2）將凝胶置培养皿、加染色液、37℃闭光至色带 出现（约15min，染色时间适当）； 3）7％醋酸终止酶促反应； 4）置保存液2—3 hr，制干板。
最后将不同组织上清液分装成100ul/管，做好标记待分析！
第二部分 乳酸脱氢酶同工酶的电泳分离
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一、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶: 是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催 化剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵(AP)或核黄 素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物 的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
2.分离胶的制备
1号试剂（电泳缓冲液）
2.5ml 1次
2号试剂
5.0ml 1次
双蒸水
2.5ml 1次
3号试剂（凝胶浓度7.5%，Ph8.9） 10ml 2次
➢ 置小烧杯中,混匀,迅速注入到二块玻璃板之间(短玻璃 朝负极),凝胶加至横板的0.3cm处；
➢ 在室温中聚合20-30分钟。 ➢ 注意：acr/bis有神经毒/制胶时避免产生气泡
工酶有哪些相同之处和不同之处？
其他注意事项
爱惜电泳装置，轻拿轻放，避免产生划痕，损坏需 赔偿！
染色液价格昂贵，按量发放（两块胶10mL），随 用随取，注意避光，否则影响染色效果！
实验完成后，将电泳装置洗净，所用配件放回盘中， 老师检查合格后方可离开！
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三、实验报告要求
1. 原理（连续体系电泳分离，活性染色） 2. 操作（简练陈述实际操作） 3. 结果（铅笔绘图：正负极，条带数目、强弱、距
离，某组织） 4. 结果说明（同工酶的组织特异性） 5. 思考题
1)何谓不连续体系？不连续体系的浓缩效应是怎样实现的？ 2)操作中有哪些关键环节？应做何处理？ 3)用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质和分离乳酸脱氢酶同
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关于乳酸脱氢酶
1959年Markert等用电泳的方法将纯化的心肌乳酸脱氢酶(LDH) 分离出5条区带，由阳极到阴极依次命名为LDH1、LDH2、LDH3、 LDH4、LDH5，它们均具有LDH催化活性，从而首先提出了同工酶 的概念。目前已知LDH同工酶是由H和M亚基按不同比例组成的四 聚体。
LDH同工酶广泛存在于动植物及微生物中，动物各组织中LDH 同工酶各组分含量不同。临床上对LDH及同工酶的检测可作为某些 疾病诊断的依据之一。
实验三 组织匀浆的分离制备&乳酸脱氢酶同
工酶的电泳分离
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教学目的：
1. 学习组织匀浆的方法和离心机的使用方法； 2. 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理； 3. 掌握聚丙烯酰胺凝胶分离乳酸脱氢酶的操作技术； 4.掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色。
重点难点：
1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理； 2. 连续体系和不连续体系。
1. 晶状体 2. 脑 3. 心脏 4. 肝脏 5. 肾脏 6. 卵巢 7. 肌肉
15μL 15μL 15μL 15μL 15μ没过短玻璃；上样时不要扎破加样孔， 也要避免样品溢出。
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电泳结果实例
1
2
3
4
LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1
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不连续系统 是指使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体 系的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶的堆积作用， 可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，对样 品进行浓缩，然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离， 既存在电荷效应，也有分子筛效应。虽然制胶操作难度较大， 但是它具有连续系统不可比拟的优越性，分辨率高。
二、实验步骤 分离胶的制备
浓缩胶的制备 待分离样品的准备
加样
电泳
（电压100-120v，电流20mA）
染色
电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色 液，染色30min；
二、实验步骤 1. 制胶板
1）安装胶槽（注意正负极、胶槽螺钉受力一致）； 2）1%的琼脂糖封底（封底迅速，避免气泡）； 3）灌浓缩胶至上沿约0.3cm处、胶槽两边加自来水至低 于凝胶高度、插梳子（避免气泡）、待凝胶聚合后将水倒 掉、取出梳子、滤纸吸水； 4）用夹子封闭电极液出口、加电极液；
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乳酸脱氢酶同工酶活性染色
用活性染色对LDH进行鉴定，将凝胶浸泡在活性染色液 中，LDH与底物的反应，用甲硫吩嗪(PMS)作为电子的中间 载体，氯化硝基四氮唑蓝(NBT)作为最终电子受体，底物脱 下的氢最后传递给NBT，NBT被还原后，产生蓝紫色的不溶 于水的物质以对LDH定位。反应式如下：
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O
O
O
CH2 = CH—C—NH2 CH2
(Acr)
+ CH2 = CH—C—NH—CH2—NH—C—CH =
聚合反应
(Bis)
自由基
交联
（聚丙烯酰胺）
聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：
1. 凝胶透明，有弹性，机械性能好； 2. 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应； 3. 对pH和温度变化较稳定,几乎无吸附和电渗作用； 4. 样品用量少，灵敏度可达10-6g; 5. 凝胶孔径可调节； 6. 分辨率高。
电极缓冲液：pH8.3的Tris-Gly缓冲系统。 即形成一个凝胶浓度、成胶成分、pH、电泳缓冲系统各不
相同的不连续系统。
蛋白质在净电荷聚丙烯酰胺凝胶 电泳中的分离因素
电荷因素 分子大小 分子形状
电荷因素 蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同 分子大小 蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同 分子形状 蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同
不连续电泳的四个不连续性 凝胶浓度的不连续性； 缓冲液离子成分的不连续性；缓冲液pH梯度的不连续性；电 位梯度的不连续性。
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常用聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续体系
上层胶为低浓度的大孔胶（浓缩胶）：凝胶浓度2.5%、 pH6.7的Tris-HCl缓冲系统；
下层胶是高浓度的小孔胶（分离胶）：凝胶浓度7.5%、 pH8.9的Tris-HCl缓冲系统；
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聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型
连续系统 是指电泳系统采用相同孔径的凝胶、缓 冲系统等条件下进行区带电泳，是利用蛋白质分子的电荷 效应进行分离，凝胶的分子筛效应不明显，一般只用于分 离一些比较简单的样品，缺点是分辨率不高。优点是制胶 简单快捷，缓冲系统的pH恒定，可以防止样品进胶后因 pH变化发生凝聚和沉淀，缓冲系统组成简单。
第一部分 组织匀浆的制备
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一、组织样品的采集
在实验动物功能评价中，需要采集的生物样品 主要是组织脏器，它是反映受试物的生物学效应和物 质在体内代谢情况的最为重要的途径。
将动物组织细胞在适当的缓冲液中研磨，使细胞 破坏，细胞内容物溶解或悬浮于缓冲液中形成混悬液。
匀浆的方式
手工匀浆 机器匀浆 超声匀浆 反复冻融
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二、操作方法：
1、脑处死乌鳢，取组织（晶状体、心脏、肝脏、肾脏）（大约0.5g ），在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入 研钵内。 2、用移液管量取预冷的匀浆介质（20%的蔗糖溶液）1.5ml,匀浆介 质的体积总量应该是组织块重量的9倍 3、手工匀浆:操作要在冰水浴中进行，将盛有组织的研钵放入冰水 中 4、将制备好的10％匀浆用低温高速离心机12000r/min左右离心45分 钟，将离心好的匀浆取上清待分析检查。
凝胶的总质量浓度T和交联度C决定凝胶的有效孔径。凝 胶的三维网状结构具有分子筛效应，不同大小和形状的大 分子通过孔径时所受的阻滞力不同，加上大分子的电荷效 应，使各种大分子迁移率不同得以分离。
大多数蛋白质在7.5%凝胶中能得到满意的结果，所以 这个浓度的凝胶称为标准胶。
当分析一个未知样品时，常用标准胶或梯度凝胶来测 试，而后确定适宜的凝胶浓度。
AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进 行。
电泳 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向 移动，这种现象称之为电泳。
AP-TMTED催化体系
TEMED催化AP生成硫酸自由基：
S2O82－
2SO4·¯
硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：
Bis将单体长链间连成网状结构：