微悬臂梁生化传感器在液体环境中的应用

微悬臂梁生化传感器在液体环境中的应用
张慧勇;潘宏青;张柏林;唐纪琳
【摘要】Microcantilever, because of its small size, fast response, and high sensitivity etc. , has rapidly developed into a new sensor technology. This review describes the working principle of microcantilever sensors, the signal readout method and the factors affecting sensitivity. The performance, application and limitation of microcantilever in aqueous solution in recent years are summarized. The future challenges and prospects in the application of microcantilever are also discussed.%微悬臂梁由于其体积小、响应速度快、灵敏度高和易于集成等特点,已迅速发展成为一门新兴的传感器技术.本文简要介绍了微悬臂梁传感器的工作原理和信号读出方法,概括了近年来它在液体环境中的研究现状,并对其性能特点和局限性进行了讨论,展望了该类型传感器今后的研究趋势.
【期刊名称】《分析化学》
【年(卷),期】2012(040)005
【总页数】8页(P801-808)
【关键词】微悬臂梁;生化传感器;液体环境;表面应力;综述
【作者】张慧勇;潘宏青;张柏林;唐纪琳
【作者单位】中国科学院长春应用化学研究所电分析国家重点实验室,长春130022;中国科学院研究生院,北京100049;中国科学院长春应用化学研究所电分析国家重点实验室,长春130022;中国科学院研究生院,北京100049;中国科学院长
春应用化学研究所电分析国家重点实验室,长春130022;中国科学院长春应用化学
研究所电分析国家重点实验室,长春130022
【正文语种】中文
生化传感器可定义为一种借助特异性的识别元件检测生物／化学分子数量或活性的装置。

它通常由两个基本要素组成：第一个要素是分子敏感层。

该层分子作为识别元件与样品分子作用或结合，是保证传感器具有特异性的关键；第二个要素是物理换能器。

它利用各种声学、光学和电学技术将分子间相互作用转变为可测量的物理信号［1］。

近年来迅速崛起的一种新型微机电装置——微悬臂梁，使生化传感器有可能发展成为一种高度集成、廉价、便携，并且能够同时高灵敏探测和识别多种分子的检测器件。

微悬臂梁生化传感器通过将发生在悬臂表面的生物化学反应转化为纳米机械运动，或者是将表面反应引起的质量变化转变为频率变化来实现检测目的，并且根据不同的要求，在真空、气相或液相环境中使用。

微悬臂梁生化传感器的研究领域涉及基因组学、蛋白质组学、环境监测、临床诊断、药物筛选和病原体检测等方面［2］，具有广泛的适用性。

本文综述了近年来微悬臂梁生化传感器在液体环境中的应用，分析了它的性能和局限性，并对其研究和应用前景进行了展望。

微悬臂梁表面上发生的分子吸附或分子识别可以导致悬臂弯曲或共振频率的变化。

结合不同的信号读出方法，微悬臂梁传感器通过两种不同的工作模式（静态模式和动态模式）监测这两个物理量的变化。

在静态模式下，表面分子间相互作用引起悬臂反应面和非反应面间的应力差，从而导致微悬臂梁的弯曲变形（偏转）。

通过测量偏转距离（应力大小）可检测分析物浓度以及相互作用性质等方面的信息。

而在动态模式下，当待测物与微悬臂梁表面结合时，微悬臂梁的质量增加，引起悬臂共振频率减小，通过测量频率的变化值即可获知吸附物的质量［1］。

微悬臂梁传感
器在两种模式下的工作原理见图1［3］，相关计算公式如下：
在静态模式中，设微悬臂梁上下表面的应力差Δσ1－Δσ2＝Δσ，式（1）中L和t 分别是微悬臂梁的长度和厚度，Δz是微悬臂梁自由端的位移，而E和v则是所用材料的杨氏模量和泊松比；在动态模式下，式（2）中f，m和k分别是微悬臂梁的振动频率、有效质量和弹性常数。

微悬臂的灵敏度与表面分子间的相互作用力息息相关［4，5］，包括静电力、空间位阻和范德华力。

另外表面疏水性的变化，以及吸附分子构象的变化也发挥了重要作用［6～8］。

利用自组装法［9，10］、交联法［11］和吸附法［12］等在微悬臂表面形成比较稳定、均一、致密的受体层，便于和目标分子结合，实现特异性识别和检测。

工作在静态模式下的微悬臂梁，实际上是一种应力传感器，通过测量悬臂两个表面间的应力差来获取分子间相互作用信息。

所以，特异性的反应必须限制在单侧表面上，并对另外一个表面进行钝化处理，以减少或消除不必要的吸附带来的干扰［13］。

据文献报道，工作在这种模式下的微悬臂梁化学传感器的检测灵敏度已经达到10-12，甚至10-15数量级［14］。

动态模式下的微悬臂梁，类似于石英晶体微天平（QCM），测量的是质量改变引起的振动频率变动。

由于悬臂的振动频率会受到环境阻尼的影响，因此也可用于检测环境的阻尼效应，这是静态模式不能获取的信息。

但是在强阻尼条件下，例如液体环境中，微悬臂梁的质量因子迅速减小，导致质量灵敏度显著降低，因而限制了动态模式的使用［12，15～19］。

微悬臂梁传感器的一个重要组成部分是一套能够将微悬臂梁的有关变化实时输出的信号检测系统。

目前它主要分为光学方法和电学方法两类，其中光学方法常用的是光学杠杆［1，20～22］和激光干涉法［23，24］；电学方法包括压阻式［25～27］、压电式［28～30］和电容式检测法［31～34］等。

光学方法既可以用于静态模式，又可以用于动态模式；压阻式和电容式多用于静态模式，压电式多用于动
态模式。

光学杠杆方法中，检测器通过测量悬臂自由端反射的激光光斑在位置探测器上移动的距离获知悬臂的弯曲量。

这种方式结构简单，是目前灵敏度最高的位移测量方法，因而得到了较广泛的应用。

压阻法是电学方法中最有发展前景的一种检测方法之一。

它将压阻材料集成于微悬臂梁中，通过惠斯登电桥将悬臂的偏转直接转换为电信号，避免了使用体积较大的光学读取设备，这在开发便携设备方面具有独到的优势。

SniffEx手持式爆炸物检
测器［35］就是这一技术的成功应用，但压阻法的灵敏度低于光学方法［36～39］。

微悬臂梁传感器自从问世以来，以其体积小、成本低和灵敏度高等优点，在生物／化学领域获得了广泛的研究和应用。

与其它生物／化学传感器一样，表面敏感层的活性和特异性决定了微悬臂梁传感器所能感知的生物或化学分子［40］，包括离
子［41～43］、小分子［10，44］、核酸［4，45～48］、蛋白质［49～51］和细菌［52］等，而其无标记检测的灵敏度已经可以与其它生物无标记检测方法相
比拟。

由于生化反应大多是在溶液中进行，因此本文着重介绍微悬臂梁在液体环境中的应用。

微悬臂梁传感器已经被成功运用于金属离子的检测，如Ca2＋［53］，Co2＋［54］，Cu2＋［55］和Pb2＋［56］等。

微悬臂梁表面修饰端基为磷酸盐或N，N－二乙基乙酰胺的硫醇自组膜后，对Ca2＋的检出限达到10-9 mol／L［53］。

除了阳离子检测外，季海峰等［41］采用类似的自组装方法将巯基十二烷基三乙
基溴化铵修饰到悬臂表面用于检测Cr，在流动池中检出限为10-9 mol／L。

该传
感器具有较好的选择性，实验显示，Cl-，Br-，S，HC，C等离子对检测的干扰很小。

随后他们以含有四烷基胺的水凝胶作为修饰层，将Cr的检出限降低了两个数量级，达到10-11 mol／L［57］。

本课题组利用微悬臂梁研究了多巴胺在金表面的吸附动力学过程［58］，并通过
微悬臂梁的偏转对悬臂梁表面多巴胺与Fe3＋的相互作用过程进行了分析，制备出具有高选择性和高灵敏度的Fe3＋传感器，检出限可达5×10-10 mol／L，在Ca2＋，Mg2＋，Mn2＋，Cu2＋，Zn2＋，Co3＋，Cr3＋和Fe2＋存在下也能实现高灵敏检测。

另外，本课题组还研究了微悬臂梁金表面键合的肽链（His－Gly－Gly）与Cu2＋的作用过程［42］。

结果显示，在高浓度的Cu2＋作用下，微悬臂梁先偏向金表面，而后又偏离金表面，可能由于Cu2＋首先与肽链上的羧基和咪唑环配位诱导产生拉应力，随后与氮原子的作用引起肽链分子构象变化，导致了压应力。

而在低浓度的Cu2＋作用下，可能由于没有配位诱导产生拉应力，只观察到构象变化产生的压应力。

Zhao等［59］用单克隆抗体mAb6A9修饰的悬臂梁检测Cu－EDTA络合物，检出限低于1× 10-9g／mL，该研究工作为检测复杂样品中的金属离子提供了一种新的思路。

Yang等［44］以Cu2＋／L－半胱氨酸双层分子膜修饰微悬臂梁，利用半胱氨酸与磷酰基的特异性作用检测水溶液中的神经毒剂有机磷化合物，展示了很好的灵敏度和选择性，检出限10-15 mol／L。

微悬臂梁传感器以其无标记检测、快速高通量分析的能力、极高的灵敏度和微小的尺寸成为生化传感器中很有潜力的发展方向。

最近的研究显示，溶液中微悬臂梁检测生物样品的质量灵敏度在10-12～10-15g范围，浓度灵敏度在10-9～10-15 mol／L范围［60，61］。

利用静态或动态模式的微悬臂梁对寡聚核苷酸［4，45～48］、蛋白［49～51］和细菌［62］进行了广泛研究。

此外，微悬臂梁还应用于实时监测生物化学反应过程，如监测纤维素的水解，为全面理解纤维素酶解过程提供了依据［63］。

3.2.1 DNA和DNA之间的相互作用 DNA检测是微悬臂梁生物传感器发展过程中的一个里程碑（表1）。

Fritz等［64］首先报道了微悬臂梁阵列研究核酸杂交的实验，他们将巯基化的寡聚核苷酸链修饰到微悬臂梁表面，然后与溶液中的互补单链相互作用，DNA的杂交过程转化为微悬臂梁的机械偏转，如图2所示［64］。

实验中使用了两支悬臂梁的阵列，一支通过功能化修饰上12个碱基的核酸互补链，作为工作悬臂；另一支键合惰性分子后，作为参比悬臂。

利用该方法识别单链DNA，可以检测单个碱基的不匹配，避免了复杂而昂贵的生物标记。

在微悬臂梁
表面修饰DNA，也可以用于研究DNA链的长度和盐的浓度对杂交效率和表面修
饰DNA的密度的影响［65，66］。

Callej等［67］用新型的聚合物材料SU－8
微悬臂梁检测单链DNA的吸附，灵敏度是商业氮化硅悬臂梁的6倍。

微悬臂梁不仅用于DNA的杂交及解离的研究，而且用于DNA的二级结构研究，Zheng等［45］在动态模式下使用锆钛酸铅（PZT）微悬臂梁研究了核酸二级结构与悬臂
振动频率间的关系，发现当具有二级结构的DNA单链与互补链结合后，微悬臂梁的振动频率上升；而没有二级结构的DNA单链杂交后，振动频率下降。

这是由于当单链中存在二级结构时，内部存在互补碱基对使悬臂梁表面刚性增加，而与互补链杂交后，刚性的减少使悬臂的振动频率上升。

3.2.2 蛋白质检测微悬臂梁传感器已被广泛用于定量测量蛋白质，例如前列腺抗原（PSA）［13，73，74］、C－反应蛋白（CRP）［75，76］、重组单链抗体（scFV）［77］、免疫球蛋白（IgG）［78，79］和肌红蛋白（myoglobin）［50，80］等。

微悬臂梁表面修饰抗体可以在超低浓度检测癌症标记物甲胎蛋白（AFP），检测极限为2×10-9g／mL［81］。

我们小组［82］研究了硅表面上
共价键合的生物素与亲和素作用，结果显示，悬臂梁偏转的程度和速率与亲和素的浓度相关，亲和素浓度越大，反应速率越快，悬臂梁偏转的程度越大。

Wang等［83］将微悬臂梁用于药物制剂中溶菌酶含量的测定，通过微悬臂梁的偏转监测
了溶菌酶在正十二硫醇修饰的微悬臂梁上的吸附过程。

当溶菌酶浓度在1.0×10-2～1.0×10-4 g／L范围内时，其浓度的对数值与微悬臂梁的偏转值呈良好的线性关系，检出限为5.0×10-9 g／L。

微悬臂梁传感器有希望成为肿瘤的早期预防与
诊断的检测工具。

3.2.3 细菌检测随着细胞研究的不断发展，人们开始利用微悬臂梁传感器研究细菌的生长变化和相互作用（表2）。

Ilic等［62］利用振动模式的微悬臂梁实现了大肠杆菌单细胞的检测。

最近，Tzeng等［84］报道了大肠杆菌ORN178与微悬臂梁表面的α－D－甘露糖作用引起悬臂梁振动频率改变，而大肠杆菌ORN208与
悬臂梁上的α－D－甘露糖结合力弱，不能引起明显的频率变化。

Dhayal等［85］利用八悬臂梁阵列芯片，其中4个悬臂梁修饰结合肽（NHFLPKV－GGGC），其
它4个悬臂梁修饰对照肽（LFNKHVPGGGC）。

该研究证明了在液体中短肽配体可以有效捕捉枯草芽孢杆菌的孢子，检测结果通过暗场显微镜得到进一步确认。

这项技术将应用于病原微生物（包括生物战剂）检测。

3.2.4 适配子（Aptamer）传感器核酸适配子具有特异性强、不依赖细胞或动物、能用化学合成的方法制备、能长期储存和常温下运输的优点，并且能与其结合的生物或化学分子非常广泛，包括金属离子、小分子、毒素等，甚至无免疫源性的分子都可以与之产生高亲和力。

因此基于适配子的检测方法得到迅速发展。

Hwang等［92］用RNA适配子作为受体，以动态模式实现了HCV螺旋酶的无标记检测；Wang等［93］利用微悬臂梁研究了适配子与血小板源性生长因子（PDGF）的结合与解离速率常数和温度之间的关系，实验表明，在19～37℃，它们的相互作用具有显著的温度相关性。

Shu等［49］用缩氨酸适配子修饰的微悬臂梁检测细胞
溶解液中的CDK2蛋白，同时采用内参考悬臂梁以减少热漂移和非特异吸附的影响，并通过石英晶体微天平的对比实验，证明了检测的有效性。

最近，Kang等［94］将可卡因适配子修饰在微悬臂梁上，通过测量悬臂梁（实验和对照）的表
面应力差值，实现了不同浓度可卡因的检测，检出限为5×10-6 mol／L。

微悬臂梁传感器是随着寻找高灵敏度、结构简单的检测手段而发展起来的新兴技术。

其广泛的适用范围，独特的检测方式，使其可提供了与其它传感器不同和互补的信息。

这种技术与传统的传感器相比，显示出非常低的检测极限，并且在生物无标记
检测方面，达到了比肩现有技术的能力在药物筛选和医疗诊断领域展现出巨大的应用潜力。

高通量多目标检测一直是传感器的发展方向，运用微悬臂梁阵列就能实现多种组分的同时检测。

微悬臂梁传感器已成为生物传感器领域极具竞争力的技术，但是要发展成为一个高度敏感的和可靠的检测平台，仍面临一些必须解决的问题。

对于静态模式下的微悬臂梁传感器，首先，它需要一个成熟的表面修饰方法，以便建立均匀的受体层。

制备良好的表面受体层可以增强分析物－受体相互作用，增大表面应力，并保证实验的重现性。

其次，到目前为止，表面分子相互作用诱导产生表面应力在理论上还没有完备的解释，这直接导致缺乏理论来预测静态模式微悬臂梁的响应方式［3］。

这主要是由于表面应力源的复杂性，表面上的分子之间的静电作用、氢键、立体位阻、渗透压、熵效应、电荷重分布等，一种或几种因素的变化都可能引起表面应力差。

因此，只有从简单的模型体系入手，研究其表面应力变化的原因，才能逐步深入到更复杂的体系。

今后基于悬臂梁传感器研究工作的重点在于解决测量中的各种技术难题，并不断完善和发展微悬臂梁传感器的检测理论，促进这项技术早日成熟。

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