离子色谱-电导检测法测定豆奶粉中的亚硝酸盐和硝酸盐含量

离子色谱-电导检测法测定豆奶粉中的亚硝酸盐和硝酸盐含量王智聪;冯炫;余笑波;沙跃兵
【摘要】该文建立了豆奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐含量的测定方法.豆奶粉样品经乙酸低温沉淀和固相萃取净化,采用离子色谱-电导检测分析,并考察了线性、检出限、准确性、精密度和加标回收率等.结果表明,亚硝酸盐(以NO2-计)和硝酸盐(以
NO3-计)分别在0.01～0.20μg/mL和0.10～2.00μg/mL的范围内线性良好,相关系数(r)均大于0.99,在豆奶粉中的检出限分别为0.04/0.016mg/kg(NO2/NO3);加标回收率分别为94.3％/97.1％(NO2/NO3);方法的准确性分别为91.0％/96.5％(NO2-/NO3-),精密度分别为2.7％/1.4％(NO2-/NO3-).对市售4种豆奶粉样品进行筛查,亚硝酸盐和硝酸盐的含量均小于国家限量标准.本方法简便快速、灵敏度高、准确性、重复性好,可用于豆奶粉质量控制中亚硝酸盐和硝酸盐含量的测定.
【期刊名称】《安徽农学通报》
【年(卷),期】2015(021)022
【总页数】4页(P110-112,141)
【关键词】豆奶粉;亚硝酸盐;硝酸盐;离子色谱
【作者】王智聪;冯炫;余笑波;沙跃兵
【作者单位】浙江省计量科学研究院,浙江杭州310018;浙江省计量科学研究院,浙
江杭州310018;浙江省计量科学研究院,浙江杭州310018;浙江省计量科学研究院,浙江杭州310018
【正文语种】中文
【中图分类】TS252
亚硝酸盐可以与体内蛋白质分解产生胺形成亚硝胺，同时亚硝酸盐也可以使血液中的Fe2+氧化为Fe3+，从而使正常的血红蛋白转变为高铁血红蛋白而失去携氧能力，引起高铁血红蛋白症，严重时可致死；硝酸盐在体内可通过肠道微生物及唾液等的作用转变为亚硝酸盐［1-2］。

据报道，1999-2008年我国由亚硝酸盐引起的食物中毒有237起案例，其中死亡35人［3］。

豆奶粉是以大豆和乳制品为主要
原料，经磨浆、加热灭酶、浓缩、喷雾干燥而制成的粉状或微粒食品，富含多种营养成分，深受国内老百姓喜爱。

在豆奶粉的生产、加工、储藏、运输及使用过程中，容易变质产生微量的亚硝酸盐和硝酸盐。

因此，监测豆奶粉中的亚硝酸盐和硝酸盐含量，对豆奶粉的技术质量标准的建立和产品质量安全评价具有非常重要的意义。

食品中亚硝酸盐和硝酸盐的检测方法有分光光度法（如国标GB 5009.33-2010中的第二法和第三法）和离子色谱法（如国标GB 5009.33-2010中的第一法）等。

在分光光度法中，亚硝酸盐采用对氨基苯磺酸+盐酸萘乙二胺法测定，或磺胺+N-1-萘基-乙二胺二盐酸盐法测定；硝酸盐采用镉柱还原成亚硝酸盐，测得亚硝酸盐
总量，由此总量减去亚硝酸盐含量，即得试样中硝酸盐含量。

镉柱还原法操作复杂繁琐，重现性差，不适宜大批量样品的检测；同时，镉对实验操作人员具有潜在的危害，对环境也容易造成污染。

而离子色谱法样品前处理简便、快速，专属性好，已用于多种食品中亚硝酸盐和硝酸盐含量的测定［4-8］。

本文在国标第一法“离子色谱法”的基础上进行了改进，旨在简化样品前处理过程，优化色谱分离条件，通过方法学考察，对市售豆奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐的含量进行筛查，为豆奶粉的质量安全提供有力保障。

1 材料与方法
1.1 仪器与试剂（1）仪器：ICS-2100型离子色谱系统，配ASRS型抑制器及电
导检测器（美国DIONEX公司）；SQP型精密电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；2-16KL型冷冻离心机（美国SIGMA公司）；Milli-Q超纯水
系统（美国MILLIPOR公司）；KQ-100DE型数控超声波清洗器（昆山超声仪器
有限公司）；电子连续等分移液器（德国BRAND公司）。

（2）试剂：乙酸（分析纯）购自Sigma-Al⁃drich公司；C18固相萃取柱购自美国Waters公司；水中亚硝酸根离子溶液有证标准物质（1 000μg/mL，U=2%，k=2）和水中硝酸根离子溶液有证标准物质（1 000μg/mL，U=1%，k=2）由浙江省计量科学研究院提供；豆奶粉样品购自当地超市。

1.2 实验方法
1.2.1 标准工作溶液的配制准确吸取适量亚硝酸根和硝酸根离子溶液有证标准物质，用超纯水稀释，配成浓度分别为1.00/10.0μg/mL（NO2-/NO3-）的混合中间溶液；再用超纯水系列稀释该中间溶液，配成浓度分别为0.01/0.10、0.02/0.20、0.04/0.40、0.06/0.60、0.08/0.80、0.10/1.00、0.15/1.50、0.20/2.00μg/mL （NO2-/NO3-）的混合标准工作溶液。

1.2.2 样品前处理准确称取豆奶粉样品1.25g（精确至0.01g），置于50mL 离心管中，加超纯水40mL，摇匀，超声30min，加入3%乙酸水溶液1mL，于4℃放置20min，取出放置至室温，再加超纯水10mL，摇匀，并于9 400r/min离心
15min。

取适量上清液过C18固相萃取柱（使用前依次用甲醇、超纯水活化），
弃去前面5mL，收集后面洗脱液待测。

1.2.3 色谱条件阴离子色谱分析柱为DIONEX IonPac AS19（4×250mM），保
护柱为DIONEX IonPac AG19（4×50mM）；柱温为30℃；电导检测池温度为35℃；抑制器电流为180mA；进样体积为50μL；淋洗液为氢氧化钾溶液；流速
为1.3mL/min；梯度洗脱，5mmol/L保持33 min，1min上升至 50mmol，
50mmol/L 保持 5min，1min 降至 5mmol，5mmol/L保持5min。

2 结果与分析
2.1 样品前处理方法的优化豆奶粉中含有大量的蛋白质，样品前处理参考国标GB 5009.33-2010第一法“离子色谱法”中乳粉的提取方法，采用乙酸低温沉淀蛋白的方法。

实验中也改进了国标方法中样品提取的一些步骤，如采用离心管沉淀蛋白，并使用电子连续等分移液器准确添加水及乙酸溶液，避免了容量瓶定容等繁琐的操作；同时，采用离心管，蛋白沉淀后补足水，可以直接离心，避免了使用滤纸过滤等步骤。

改进的方法简单、快速，可以进行批量操作，效率高，批次重复性好。

豆奶粉基质复杂，除含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质以外，还添加了多种食品添加剂，采用固相萃取的方法可以有效去除脂肪、维生素、植物油等C18柱有
保留的组分。

在国标GB 5009.33-2010方法中，还需依次通过Ag柱和Na柱，
以去除氯离子和钠离子的干扰。

在本实验中，氯离子和亚硝酸根离子具有良好的分离度，如图1所示。

因此，无需再通过Ag柱和Na柱进一步净化。

图1 豆奶粉加标样品中亚硝酸盐和硝酸盐的离子色谱分析谱
2.2 离子色谱分离条件的优化在豆奶粉样品的前处理过程中，使用乙酸低温沉淀
蛋白的方法，离心后上清液非常清澈，微量的沉淀及悬浮颗粒可以通过固相萃取进一步去除，说明乙酸低温沉淀蛋白的方法效率较高。

但是，该方法在样品溶液中引入了乙酸，乙酸对离子色谱的分离有一定的影响，如图1中保留时间6～8min的色谱峰。

在离子色谱分离中需要优化洗脱条件，避免乙酸、氯离子及干扰杂质的影响。

实验比较了不同浓度氢氧化钾洗脱的情况，采用高浓度的氢氧化钾，亚硝酸根和硝酸根离子洗脱较快，但与杂质的分离度较差，如采用20mM氢氧化钾，亚硝酸根离子与氯离子后面的杂质不能实现基线分离，同时乙酸及氯离子峰拖尾对亚硝酸根离子的定量造成影响。

实验采用5mM氢氧化钾洗脱，如图1所示，亚硝酸
根和硝酸根离子均与杂质实现基线分离，浓度较大的乙酸及氯离子对亚硝酸根离子也没有影响。

2.3 线性及方法检出限如1.2节所述，配制不同浓度的亚硝酸根和硝酸根离子混合标准工作溶液，在优化的色谱条件下进行测定，以亚硝酸根或硝酸根离子的浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积（μS*min）为纵坐标绘制标准曲线，进行线性拟合，如图2所示。

对亚硝酸根和硝酸根离子，其回归方程分别为Y=0.2635X-0.0007
和Y=0.3132X-0.0117，相关系数（r）分别为0.999 39和0.999 78。

可以看出，对亚硝酸根离子，在0.01～0.20μg/mL的范围内线性关系良好，对硝酸根离子，在0.10～2.00μg/mL的范围内线性关系良好。

以标准曲线的最低点为定量下线，对应豆奶粉的最低定量限为0.40/4.00mg/kg（NO2-/NO3-）。

以3倍信噪比计算方法的检出限，亚硝酸根和硝酸根离子的检出限分别为0.001μg/mL和
0.0004μg/mL，对应豆奶粉的检出限分别为0.04mg/kg和0.016mg/kg。

图2 亚硝酸盐和硝酸盐的标准工作曲线
2.4 方法的准确性和精密度由于缺乏豆奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐成分分析的基体
标准物质，以及由于标准工作溶液和豆奶粉样品基质溶液的差异，不能直接测定方法的准确性。

本实验中采用方法空白溶液加标的方法，测定方法的准确性和精密度（相对标准偏差，RSD）。

具体方法为：准确吸取49mL超纯水，加入1mL3%乙酸水溶液，混匀，作为方法空白溶液；添加适量亚硝酸根离子和硝酸根离子的标准溶液，配制成浓度分别为0.10/1.00μg/mL的空白基质加标样品，平行制备6份
进行测定。

对亚硝酸根离子，方法的准确性和精密度分别为91.0%和2.7%，对亚硝酸根离子，方法的准确性和精密度分别为96.5%和1.4%。

2.5 加标回收率准确称取豆奶粉样品1.25g，按低、中、高3个浓度水平加入适量的亚硝酸根和硝酸根离子标准溶液，按1.2.2节进行样品的前处理（对加标回收率考察的样品，对第一次加入超纯水的体积适当调整，使得添加亚硝酸根和硝酸根离子标准溶液的体积与超纯水的体积总量为40mL），豆奶粉本底测定样品及添加3种不同浓度水平考察回收率的样品各平行制备3份，按实验方法进行测定，结果
如表1所示。

由表1可以看出，添加3种不同浓度水平的亚硝酸根离子和硝酸根
离子，平均加标回收率分别为94.3%和97.1%。

表1 豆奶粉中亚硝酸根和硝酸根离子的加标回收实验结果（n=3）Analyte Background（mg/kg）Averagerecovery（%）NO2-94.3 NO3-0 0 Addition （mg/kg）0.80 1.60 3.20 8.00 16.0 32.0 Found（mg/kg）0.73 1.52 3.09
7.99 15.1 31.0 Recovery（%）91.3 95.0 96.6 99.9 94.4 96.9 97.1
2.6 豆奶粉样品中亚硝酸盐和硝酸盐含量的测定按照1.2节实验方法，测定市售的2种品牌4种豆奶粉中亚硝酸根和硝酸根离子的含量，结果见表2。

从表2可以看出，所测试的4种豆奶粉中亚硝酸根的含量均小于0.50mg/kg，硝酸根离子的含
量均小于7.00mg/kg。

吕岱竹［9］采用离子色谱法测定了市售3种不同品牌的
豆奶粉样品，其中亚硝酸盐（以NO2-计）和硝酸盐（以NO3-计）的含量分别为13.21～13.69mg/kg和127.3～129.5mg/kg，均高于本文测试的结果，可能是
其方法中标准曲线的浓度太高，其中亚硝酸根离子的线性范围为1～25mg/mL，
硝酸根离子的线性范围为1～100mg/mL，均高于本文标准浓度的数十倍。

我国
国家标准《速溶豆粉和豆奶粉》（GB/T 18738-2006）的相关技术指标中并没有
规定污染物亚硝酸盐和硝酸盐的含量限值；在国家标准《食品中污染物的限量》（GB2762-2012）中也没有明确规定豆奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐的限量。

如果按
照“乳粉”中亚硝酸盐的限量计算（以NaNO2计，限值为2.00mg/kg；或以
NO2-计，限值为1.30mg/kg），以及“婴幼儿谷类辅助食品”中硝酸盐的含量
计算（以NaNO3计，限值为100mg/kg；或以NO3-计，限值为73.0mg/kg），上述测定的4种豆奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐的含量均小于限量标准。

表2 豆奶粉样品中亚硝酸盐（以NO2-计）和硝酸盐（以NO3-计）的含量（平均值±SD，n=3，mg/kg）注：LOQ：最低定量限（对亚硝酸根离子，LOQ为
0.400mg/mg；对硝酸根离子，LOQ为4.00mg/mg）。

Sample 4#0.48±0.01
5.87±0.05 Analyte NO2-NO3-Sample 1#＜LOQ 4.59±0.12 Sample 2#＜LOQ ＜LOQ Sample 3#＜LOQ
6.50±0.12
3 结论
本文建立了豆奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐含量测定的方法，通过优化样品前处理条件和离子色谱分离条件，实现了亚硝酸根和硝酸根离子与杂质的基线分离，对线性、检出限、准确性、精密度和加标回收率等进行了方法学考察，并用于实际样品的分析测定。

结果表明，该方法具有样品前处理简单快速、检出限低、准确性高、重复性好等特点，可用于豆奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐含量的测定，对豆奶粉的质量控制和安全评价具有重大的意义。

参考文献
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