液质联用技术在天然产物分离中的应用

液质联用技术在天然产物分离中的应用
摘要：本文综述了液质联用技术的发展状况，及其组成、特点、和仪器分类，并且总结了它在天然药物成分如黄酮类，生物碱，萜类，香豆素类成分分离分析中的应用。

关键词：液质联用；天然产物；分离
引言
20世纪80年代，质谱技术的发展发生了大的飞跃，出现了很多软电离技术，如快原子轰击电离子源(FAB)，基质辅助激光解吸电离源(MALDI)，电喷雾电离源(ESI)，大气压化学电离源(APCI)。

APCI电离源的优势在于分析弱极性或中等极性的小分子化合物，但是不适合大分子研究，主要应用于环境检测和药物分析等研究领域。

ESI适用于中等极性到强极性的化合物，可用于分析在溶液中能事先形成离子的化合物和获得多个质子的蛋白质、肽等大分子化合物。

这两种离子源都具备使溶液气化、样品电离等性质，成功地解决了液相色谱和质谱之间的接口问题，使得液质联用技术逐渐发展成为一种成熟的技术[1]。

液质联用(LC/MS) 是指液相色谱与质谱串联的技术。

HPLC 是目前分离复杂体系最为有效的分析工具，由于天然药物中含有结构、性质不同的多种复杂成分，而且有效成分的含量往往较低，因此为了深入研究和开发天然药物，必须从复杂的中草药组分中提取、分离鉴定出有活性的单体纯样，由于液质联用仪器自动化、普及化程度愈来愈高，已成为中药分析最常用的仪器之一[2]。

1液质联用的特点
1.1液质联用仪器的组成
液质联用仪是由HPLC、接口装置、及MS三大单元组成。

其中接口装置是关键。

API接口是目前商品化LC-MS仪采用最广的接口，主要包括电喷雾电离
(ESI)，离子喷雾电离（ISI）和大气压化学电离(APCI)三种操作模式。

电喷雾电离及大气压化学电离接口是一项实用、高效的常压“软”离子化技术，具有离子化效率高、离子化模式多样、可测定高分子量蛋白质和热不稳定化合物、易与大流量HPLC联机使用等优点，被人们称为LC-MS技术乃至质谱技术的革命性突破[3]。

1.2液质联用分析的特点
液质联用分析样品的前处理过程简化，使样品分析更简便。

对流速和流动相有一定的要求，流动相应使用纯水及色谱纯级试剂，其中禁止使用任何无机酸、卤酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸金属盐、表面活性剂及其它不可热分解为气体的化合物，可使用甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵、碳酸氢铵、氨水，慎用氧氟酸。

流动相中有必要使用挥发性盐时，其浓度应控制在20mM以内，酸则控制在0.1%以内[4]。

HPLC-MS分析进行的关键是液相色谱分析方法的建立及质谱分析条件的优化。

质谱分析条件的优化则要根据目标化合物的分子量及结构、结合样品浓度、基质特点及流动相组成，调整质谱扫描范围，优化多级碎裂电压。

1.3常用的液质联用仪器
按照质谱检测器进行分类，目前比较常用的HPLC-MS/MS仪器见表1。

2天然药物
天然产物为我国经济发展与人类健康方面作出了重大贡献。

中国现存最早的药学专著《神农本草经》，明朝李时珍编著的《本草纲目》以及清代赵敏学编著的《本草纲目拾遗》就记载了大量的天然药物。

在我国，天然药物又被称之为中草药，它与中医一起构成了中华民族文化的瑰宝，是全人类的宝贵财富。

天然药物之所以能够防病治病，是因为基于其物质基础的有效化学成分起到了关键作用。

由于当今世界国际化进程加速，我们的中药要走向国际市场就必须对其成分进行标准性研究，这就必须借助现代化仪器，而液质联用仪器就是其中的一种，在天然药物成分如黄酮类，生物碱，萜类，香豆素类成分的分离分析中扮演了极其重要的角色。

表1常用的液质联用仪器
质谱检测器适用范围和特点
单级四级杆质谱仪适用于基质中无化学背景干扰的定性、定量分析，
可通过离子源内CID具有使离子诱导裂解实现“准
MS/MS”功能，只能得到低分辨率的质量数
三重串联四极杆质谱仪可通过其MS/MS功能进行定性分析或用选择反应监
测(SRM)模式进行定量分析。

在所有的质谱分析仪
中，QMS定量分析结果的准确度和精密度最好。

四极离子阱质谱仪适合于目标化合物、肤及蛋白质的结构解析及确认，
但其定量分析能力在动态范围及稳定度上皆不如四
级杆质谱
四极杆-飞行时间质谱仪结合四级杆质谱的高灵敏度和TOF的高分辨率。

傅里叶变换质谱仪高灵敏度、高精度、高分辨率，在测定化合物时可
以准确生成分子式，提供可靠的鉴定结果
2.1黄酮类
黄酮类化合物广泛分布于植物界，并具有较强的生物活性，例如抗菌作用、抑制癌细胞的生长或抗癌作用、解痉挛作用和降低血压作用等[5]。

黄酮类化合物不但在医药上有着广泛的应用而且在日常生活当中可作为功能食品添加剂、天然氧化剂、天然色素和甜味剂等。

由于黄酮类化合物重要的药用价值和保健作用，对于复杂天然产物中的黄酮类化合物进行分离分析对其进一步的研究工作起着指导作用，同时对于其应用和产品开发也具有重要的意义[6]。

郭继芬等[7]选用Discovery C18柱，以甲醇-水-甲酸为流动相，经紫外检测后，在ESI扫描方式下，对HPLC-UV图谱中各色谱峰进行一级和二级质谱分析，对照品比较鉴定了提取物中4个已知的黄酮类化合物，推断出3个未知黄酮苷类化合物可能的结构。

Natividad等[8]采用LC - MS法对胶蔷树Cistus ladanifer L. 叶分泌的树脂进行分析，分离鉴定了芹菜素、4’-甲基芹菜素、7 - 甲基芹菜素、7 ，4 -二甲基芹菜素、3 -甲基山柰酚、3 ，4’-二甲基山柰酚、3 ，7 -二甲基山柰酚、3 ，7 ，4’-三甲基山柰酚等8个黄酮类成分。

2.2生物碱类
生物碱一般指存在于生物体内的碱性含氮化合物，多数具有复杂的含氮杂环，有光学活性和显著的生理效应[9]。

生物碱具有抗肿瘤作用的同时，对心血管系统、神经系统等均有一定的刺激作用，且还具有一定的抗菌、抗疟作用[10]。

许多生物碱类已被提取分离，并用作临床治疗药物。

Young-Hea Choi等[11]采用LC-ESI-MS-MS法分析了粗榧属植物三尖杉Cephalotax2us harringtonia 叶中的生物碱，分离鉴定出三尖杉碱、三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、异三尖杉酯碱、去氧三尖杉酯碱、去氧三尖杉酸、高去氧三尖杉酯碱、Cephalezomine C、Cephalezomine E等9个化合物。

陈怡等[12] 在莲子心中分离得到3种生物碱并做了定量分析和指纹图谱研究。

2.3香豆素类
香豆素类是一类具有苯并α-吡喃酮母核的天然产物的总称。

其在中药中广泛存在，也具有多种生物活性，如茵陈中的滨蒿内酯具有解痉、利胆的作用，蛇床子中的蛇床子素可用于杀虫止痒等。

孙秀燕等[13]采用HPLC-MS/MS联用仪，ESP-IT-MS对滨蒿中利胆保肝活性成分进行了分离和结构鉴定，鉴定出滨蒿中的利胆有效成分除含有绿原酸、对羟基苯乙酮、6 ，7-二甲氧基香豆素。

2.4萜类
萜类指具有(C5H8)n通式以及其含氧和不同饱和程度的衍生物，可以看成是由异戊二烯或异戊烷以各种方式连结而成的一类天然化合物，是挥发油（又称精油）的主要成分，从植物的花、果、叶、茎、根中得到有挥发性和香味的油状物。

邓亦峰等[14]采用HPLC- APCI-MS联用技术，以选择离子监测( SIM )方式测定了半边旗中二萜类化合物，该方法可用于半边旗中二萜类抗癌化合物的深入研究和生药标准的制定。

2.5甾体类
一般甾体结构中具有环戊烷骈多氢菲结构，甾核C3位有羟基取代，可与糖成苷，根据侧链的不同，又分为C21甾类、强心苷类、甾体皂苷类和植物甾醇等。

Tai等[15]用LC/ESI-MS/MS研究了蔓剪草中的C21甾体皂苷类，通过裂解[M+Na]+离子，产生A、B、C和Y系列的离子，提供了糖链和苷元的结构信息，再辅以高分辨质谱，鉴定了8种C21甾体皂苷类。

3展望
综上所述，HPLC-MS联用技术已在中药化学成分分析、中药质量控制、中药代谢产物鉴定和中药药物动力学研究等方面广泛应用。

HPLC-MS联用技术解决了传统液相检测器灵敏度和选择性不够的缺点，提供了可靠、精确的相对分子质量及结构信息，简化了试验步骤，节省了样品准备时间和分析时间，特别是适合亲水性强、热不稳定化合物及生物大分子的分离分析，有着广泛的应用前景。

中药及天然产物活性成分及其代谢物在生物样品中浓度较低，且生物样品内源性杂质较多，对分析技术提出了很高的要求。

日趋成熟的液-质联用技术具有灵敏度高、特异性强以及操作简便的优势，HPLC-NMR等联用技术的补充，必将在中药与天然产物的定量分析、靶药物成分的筛选以及药物代谢物的鉴定等分析领域发挥愈来愈不可替代的作用。

参考文献
[1] 陈娟娟. 液质联用技术在药用植物活性物质分析研究中的应用[C]. 浙江大学博士学位
论文，2009：4.
[2] 刘荣霞，果德安，叶敏，等. 液质联用技术(LC/MS)在中药现代研究中的应用[J]. 世界
科学技术-中医药现代化，2005，7（5）：33.
[3] 王海荣，张兰桐. 液-质联用中大气压电离接口技术及其在药物分析中的应用[J]. 中国医
院药学杂志，2006，26（9）：1137.
[4] 雷勇胜，宋丽明，蒋庆峰. 液质联用技术在药物的有关物质分析中的应用[J]. 2011，17（4）：9.
[5] 赵晓莉，岳红. 黄酮类化合物分析方法概述[J] . 盐湖研究，2005，13（2）：34- 39.
[6] 张玉，孙磊，黎桂辉，等. 毛细管电泳技术在天然黄酮类物质测定中的应用评述[J]. 2010，
21(4)：102.
[7] 郭继芬，陈四平，乔善义，等. 黄芩总黄酮提取物的HPLC-MS/MS分析[J] . 药物分析
杂志，2005 ，25 ( 3): 267.
[8] Natividad Chaves ，Jose J . Rios ，Carlos Gutierrez ，et al . Analysis of secreted flav onoids
of Cistus ladanifer L. by high - per formance liquid chromatogra2 phy- practical beam mass spectrometry [J] . J Chromatogra ，1998 ，799 :111-115.
[9] 南京大学化学系有机化学教研室.有机化学(下册) [M].北京：高等教育出版杜，1988：329.
[10] 周贤春，何春霞，苏力坦·阿巴白克力. 生物碱的研究进展[J]. 生物技术通讯，20006，
17(3)：477.
[11] Young Hea Chio ，K i-Pung Y oo ，Jinwoong K im. HPLC-Electrospray Ionization-MS-MS
Analysis of C ephalotaxus harringtonia Leaves and Enhancement of the Extraction Efficiency of Alkaloids Therein by SFE [J] .J Chromatogr sci ，2003 ，41 :67-79. [12] 陈怡，罗顺德，宋金春，等．莲子心中酚性生物碱3种主要成分定量分析及其特征图
谱研究[J] ．中国医院药学杂志，2004，24(4)：205-208
[13] 孙秀燕，邢山闽，李明慧，等. 用液相色谱-质谱联用法测定滨蒿中的茵陈色原酮[J] .
沈阳药科大学学报，2000 ，17 (2) :110-113
[14] 邓亦峰，梁念慈，梁统. HPLC-APCI-MS分析半边旗中二萜类化合物[J] .药学学报，
2002 ，37( 6 ): 444.
[15] Tai Y，Cao X，Li X，Pan Y. Anal Chim Aera 2006,572:230.。