Western Blot配方和方法

Western Blot配方和方法
Western Blot
配液：
1.10% SDS溶液(m/v)：
SDS 0.1g
O 1ml
DDH
2
加热溶解，室温保存，用后马上拧紧瓶盖。

2.10% 过硫酸铵:
APS 0.1g
O 1ml
DDH
2
由于过硫胺酸会缓慢分解，最好新鲜配制，或隔周配制（也可每200微升EP分装，4℃保存4W，-20℃保存1月）
3.1×电泳缓冲液
Tris base 3.028g
Glycine 14.4g
SDS 1.0g
用蒸馏水溶解至1000ml，调整PH 8.3。

冰箱内可保存数月。

4.10 ×转膜液（储存液）
甘氨酸 72.07g
Tris base 15.14g
DDH
O 400ml
2
加水至500ml，储存液不加甲醇，4℃保存。

1 ×转膜液 1L配制：
O
10 ×转膜液储存液100ml，150ml甲醇，加DDH
2 750ml，PH 8.5，定容至总量1L
5.1×转膜液（现配现用）：
Tris base 3.03g
Glycine 14.42g
甲醇 150ml
加水定容至1000ml
6.10 × TBS：
Tris base 12.1g
NaCl 40g
加水，用浓盐酸调整PH至7.6后定容至500ml 7.T BST：
1 × TBS/吐温 = 1000/1
8.封闭液：
脱脂奶粉 2g
TBST 40ml
配胶：先配分离胶，再配积层胶。

一般两者同时配制，只是最后分离胶先加TEMED混合后立即灌胶，而积层胶放4℃，等分离胶凝固后再加TEMED混匀后灌胶。

（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原来的2-3倍，根据实验当时的温度适当调整）
2ml 5%积层胶3ml
5%
积
层
胶
5ml
8%
分
离
胶
5ml
10%
分
离
胶
10%
两
块
胶
5ml
15%
分
离
胶
超纯水 1.4 2.1 2.3 1.9 2.8
5
1.1
30％Acr/Bic0.3
3 0.4
95
1.3 1.7
2.5
5
2.5
1.5 mol/L Tris·HCl （pH8.8）1.3 1.3 0.9
5
1.3
1 mol/L Tris·HCl （pH6.8）0.2
5
0.3
75
10％SDS 0.02 0.03 0.05 0.05 0.075 0.05 10%APS （过硫胺酸） 0.02
0.03
0.05
0.0
5
0.075 0.05 TEMED 0.002 0.003 0.003 0.002
0.003 0.002
双丙烯酰胺：丙烯酰胺摩尔比
1：29配制时，SDS-PAGE 有效分离范围
按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的丙烯酰胺百分比浓度，一般地，5%的凝胶可用于60～200kDa 的SDS
凝胶浓度（％）
线性分离范围（KD)
15 12-43 10 16-68 7.5 36-94 5.0 57-212
变性蛋白质分子的分离，10%用于 16～70kDa，15%用于12～45kDa。

步骤：
（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，用洗洁精将板洗净。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

（2）配胶与上样：先配分离胶，再配积层胶。

1、玻璃板对齐后放入制胶架中卡紧（一定要对
齐，以免漏胶）。

然后垂直卡在夹子上准备配胶。

2、按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立
即摇匀即可灌胶。

灌胶时，用枪吸取1ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带下缘以下5mm高度时即可，给积层胶留出足够空间（梳齿长再加1cm）。

然后胶上加一层去离子水，液封后的胶凝的更快。

（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。

操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。

加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。

）
3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝固（30min）。

再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上的水，再用去离子水洗涤数次，并用滤纸将水吸干。

4、按前面的方法配5％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。

灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。

插梳子时要使梳子保持水平（梳子使用前保证干净且干燥）。

待到浓缩胶凝固后（室温30min），将凝胶放入电泳槽中，小玻璃板面朝内（若只跑一块胶，则槽的另一边要垫一块塑料板，且有字的一面朝内）。

在上下槽内加入电泳液，上槽内的电泳液应没过小玻璃板上缘，下槽内的电泳液应没过金属丝，排除凝胶底部两块玻璃板之间的气泡。

加入电泳液后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

5、用电泳液冲洗一下浓缩胶，（目的是去除梳子遗留下的未凝固的丙烯酰胺，以免造成条带变形）可以前一天配胶备用，保鲜膜4度保存，可一周。

6、制备样品：测完蛋白浓度后，计算含20—50μg蛋白（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量，一般为40—50ug。

）的样品体积即为上样量。

取出上样样品至200μl的EP管中，加入5×SDS上样
缓冲液至终浓度为1×（上样缓冲液与样品蛋白体积之比为1:4）。

（上样体积一般在10μl与20μl之间）（其实大一点的垂直电泳槽每孔最大上样量可以达到40μl，胶做得很好的话，50μl问题也不大）上样前要将样品100℃加热5-15min使蛋白变性，立即冰浴，然后低速离心5min。

（可以使用PCR仪进行变性（95℃,10min））应根据上样缓冲液浓度的不同，制备样品。

样品分装成小管，储于-80℃。

蛋白质在非变性条件下的电泳分离是由其分子量大小与电荷共同决定的，在变性条件下与SDS结合后，其电泳分离只由分子量大小决定。

7、加足够的电泳液后准备上样。

上样之前一定要把上样孔冲洗干净，冲走未凝固的丙烯酰胺。

用移液枪将样品吸出，注意不要吸进气泡。

将枪头插至上样孔中加入样品（上样速度要快，防止样品扩散导致相互影响，但上样过快又会使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。

加入下一个样品时要换枪头，以免交叉污染）。

一般marker（Fermentas的0671或0441）加6ul。

为避免边缘效应，最好选择中间的孔上样。

8、电泳：将电泳槽与电泳仪相接，红接红，黑接黑。

跑浓缩胶时用80V，到分离胶后用120V。

溴酚
兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜（一般让目的条带跑过分离胶的1/3比较好。

当然，不要局限于此说明）。

电泳时间也取决于要检测的蛋白分子量的大小。

9、转膜
（1）从负极（黑板）到正极（透明板）方向依次：纤维垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、纤维垫，呈三明治样。

在加有转膜液的盘里放入转膜用的夹子、两块纤维垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。

（2）将夹子打开使黑的一面保持水平。

在上面垫一张纤维垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。

（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。

）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起再垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

（3）将小玻璃板撬掉，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬（撬时一定要小心，胶很易裂，要用巧劲）。

除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。

小心剥下分离胶，根据需要横向切胶，并根据胶的大小裁剪同样大小PVDF膜，剪去膜的右上角作为标记（当剪去的角在右上方时有蛋白面朝上，在右下方时有蛋白面朝下）。

如果样本多，同时做几张膜，可用铅笔在膜下角标ABCD或1234，这样可以分出膜的正反和加样顺序。

注意：裁滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。

将裁好的PVDF膜置于甲醇中浸一下才可使用。

在膜上盖3层滤纸并除去气泡。

最后盖上另一个纤维垫，擀几下就可合起夹子。

整个操作在转膜液中进行，要不断的擀去气泡。

（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通）（最后做成的“三明治”千万不能形成短路，不然有可能会短路烧坏转膜装置）。

（4）将夹子放入转膜槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。

转膜时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。

液面应该没过夹子上缘，在电泳槽周围放置碎冰，打开电源，280mA ，1.5h。

（1.应根据蛋白分子量的大小确定转膜时间，对于小分子量的蛋白，转膜时最好垫两块PVDF膜，以免转膜过头，因为如果第一张膜上蛋白质已经转过了，第二张膜上还有蛋白质可以进行检测；对于分子量大的蛋白，转膜时间要长一点，开始最好也用两块膜，特别是务必注意加强降温措施。

当然转膜是要摸条件的，最好刚开始做的时候摸个转膜的时间梯度。

如果由于时间原因来不及做下面实验，可以在4度下12V转膜过夜）（2.PVDF膜建议使用0.22μ的小孔径膜，不容易转膜过头）（3.不同
的转膜装置，转移效率是不一样的，所以换用转膜装置，最好再摸个条件）（4.转膜时电极方向注意是膜正胶负）
10、考马斯亮蓝染胶（一般不需要做这步）
转完后将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。

然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。

将膜晾干备用。

11、封闭：
洗膜：TBST洗膜一次。

封闭：5%脱脂奶粉配制：TBST 40ml +脱脂奶粉2g。

将NC膜（蛋白面朝下）移入盛有封闭液的平皿中，室温摇床孵育1h。

12、洗膜：TBST洗膜一次。

13、抗体孵育：
孵育一抗：用5%脱脂奶粉-TBST按适当比例(一般是1000:1)稀释一抗（1ml 5%脱脂奶粉：1mlTBST加
0.05g奶粉）。

裁下一块封口膜，折成小船铺于湿盒中，
将脱脂奶粉加到小船中，用移液枪把一抗注进奶粉溶液里，摇床上摇一会。

膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡。

摇床摇半小时后，放在湿盒中4℃过夜。

洗膜：TBST，室温下摇床上3～5次×5-10min。

孵育二抗：用5%脱脂奶粉-TBST按适当比例（一般小鼠5000:1，兔2000:1）稀释二抗。

将脱脂奶粉加到小船中，把二抗注进奶粉溶液里，摇床上摇一会儿。

膜蛋白面朝下放于抗体液面上，室温摇床孵育1h～2h。

洗膜：TBST，摇床上洗3～5次×5-10min。

14、曝光：（曝光的整个过程需要避光）将两种发
光剂按1:1的比例混合（一般一张膜用100ul混合液），体积根据膜的大小以及多少来定。

用移液枪将发光剂混合液洒在膜的蛋白面上，曝光。

注意事项：
1.最常见的问题是背景信号过高。

处理：进一步稀释一
抗；使用含有去污剂的封闭缓冲液；使用其他封闭试剂，如牛血清白蛋白；减少蛋白上样量
2.所有步骤均要使用去离子水。

3.手上的油脂会影响蛋白的转移，操作时应戴手套。

4.某些抗体会由于去污剂的存在而不与蛋白结合。