沙门菌检测技术

沙门菌为常见肠道病原菌之一，在自然界分布广泛，种类繁多，所致疾病统称沙门菌感染，其中由伤寒、副伤寒沙门菌引发急性全身系统性传染病是中国《传染病防治法》中要求汇报乙类传染病，而由非伤寒沙门菌引发食物中毒则占我中国陆地域细菌性食物中毒首位。

立即正确地检验沙门菌，为诊疗和控制由该菌引发疾病提供依据。

沙门菌检验程序关键包含：标本采集、标本处理和接种、菌株分离和判定和PCR检测多个步骤。

标本采集
标本采集前，应准备好所需培养基和器材，关键有：血液需氧培养瓶、血琼脂平板、XLD（木糖赖氨酸脱氧胆盐）琼脂平板、BS（亚硫酸铋）琼脂平板、SC（亚硒酸盐胱氨酸）增菌液、酒精灯、采样瓶、剪刀、镊子等。

沙门菌检验标本关键分为：食品样品、可疑食物中毒标本，沙门菌患者标本。

可疑食物中毒标本关键有：可疑食品、相关环境标本、疑似病人标本。

可疑食品采集：在采集可疑食物中毒标本时，应关键采集剩下食物和食品加工相关炊事用具，操作人员手、肛试等相关环境标本。

采样时，用棉试子涂抹物品表面后，置于少许增菌培养基内，也可依据情况在接种现场接种分离平板。

沙门菌感染患者标本采集：沙门菌感染患者应采集新鲜粪便标本或肛试子直接接种分离平板和增菌液。

对伤寒、副伤寒患者，在病程第1~2周，可采集静脉血液4~8ml，接种血液需氧培养瓶中。

每个标本需做好标识和统计，采集食品样品4℃保留，已接种标本增菌液和培养基，室温下保留，2小时内送达试验室。

标本处理和接种
沙门菌标本处理和接种常见培养基有：TTB（四硫磺酸钠）增菌液、SC(亚硒酸盐胱氨酸)增菌液、XLD琼脂平板、BS琼脂平板和麦康凯（MaC）琼脂平板。

可疑中毒食品标本处理：对采集标本通常按1:10百分比分别接种于100mlTTB和100ml 增菌液中，每瓶增菌液加入标本约10g，同时还可将可疑中毒食品标本直接接种于分离平板。

将接种后TTB增菌液置42℃培养箱中培养18~二十四小时，将SC增菌液和分离平板置37℃培养箱中培养18~二十四小时，待观察。

取培养后增菌液转种XLD琼脂平板和BS琼脂平板，将接种后平板置37℃培养箱中培养24~48小时，待观察。

血液（骨髓）标本处理：将已接种标本血液培养瓶直接放置37℃培养箱中培养7天，在培养期间分别于培养第1天、第2天和第7天取培养液一环接种血琼脂平板，将平板置37℃培养箱中培养18~二十四小时，待观察。

培养至第7天时，如培养物仍无菌生长，则可判为阴性。

肛试子及其它环境标本处理：将现场采集已接种标本分离平板和增菌液直接放置37℃培养箱中培养18~二十四小时，待观察。

取出18~二十四小时培养增菌液转种XLD琼脂平板和麦康凯琼脂平板。

将接种完成平板置37℃培养箱中培养18~二十四小时，待观察。

菌株分离和判定
关键试验试剂有：氧化酶（试剂）、三糖铁（TSI）、动力—靛基质—尿素半固体（MIU）和赖氨酸铁琼脂斜面、API20E、沙门菌诊疗血清。

沙门菌菌株判定关键试验有：菌体形态观察，菌落形态观察，氧化酶试验，初步生化判定（系统生化判定），血清学分型。

菌落形态观察：在XLD平板上沙门菌菌落呈粉红色、光滑、湿润、边缘整齐、产H2S 菌株，可形成中心黑色或全部黑色菌落。

在BS琼脂平板上，沙门菌菌落呈黑色有金属光泽、棕色或灰色，培养基周围可展现黑色或棕色，有些菌株可形成灰绿色菌落，周围培养基不变。

在麦康凯琼脂平板上，沙门菌菌落为无色、透明或半透明、光滑湿润、边缘整齐、圆形。

从分离平板上挑取3-5个能够菌落，分别接种XLD平板和营养琼脂平板，将接种完成平板置37℃培养箱中，18~二十四小时纯化培养。

菌体形态观察：挑取纯培养物进行革兰染色，在显微镜下观察菌体形态。

沙门菌为革兰阴性杆菌，长1-3um，宽0.5~1um，无芽胞，两端钝圆。

氧化酶试验：用一次性接种环（或牙签）挑取菌落于滤纸上，滴加氧化酶试剂一滴，在10s内菌落不变色为阴性，展现紫色者为阳性。

本试验菌落不变色，氧化酶试验为阴性：初步生化判定：将菌落形态和氧化酶试验符合沙门菌特征纯培养物分别接种于三糖铁琼脂斜面（TSI）、MIU培养基、赖氨酸铁琼脂斜面，将已接种生化培养基置37℃培养箱中，培养18~二十四小时，待观察。

经典沙门菌在三糖铁（TSI）上，斜面呈红色，下层产酸呈黄色，多数沙门菌产生硫化氢，试管内出现黑色，有气泡。

赖氨酸脱羧酶试验阳性，培养基由紫色变成紫黑色。

在MIU培养基上尿素为阴性培养基不变色，有动力，沿穿刺线浑浊生长，加入靛基质试剂0.5ml于试管内，轻摇试管，沙门菌靛基质试验结果不定。

本试验靛基质试验为阴性，试剂不变色。

系统生化判定：肠杆菌科细菌在生化反应上有类似之处，对初步生化试验符合沙门菌可疑菌株需要深入做系统生化判定。

生化试剂可采取自配或市售成品，也可选择生化判定试剂盒（API 20E）或全自动微生物判定系统（VITEK）。

本试验以API 20E生化判定试剂盒进行示范，具体操作步骤以下：
菌悬液制备：挑取二十四小时培养营养琼脂平板上1~2个菌落至5ml灭菌生理盐水中制成均匀菌悬液。

接种和培养：将配制好菌悬液按产品说明书要求填充API 20E条上小杯，按要求加盖矿物油，置于36℃培养箱中培养18~二十四小时，待观察。

结果观察和判定：根据说明书要求，在读取结果前，部分试验先添加附加试剂。

依据API 20E中读数表判定和统计各项反应结果，并得到一个7位数编码，经过在数据库或API 编码表中查询该编码即可取得菌株判定结果。

血清学分型：对生化判定为沙门菌菌株，需用玻片凝集法进行血清学分型，血清学分型试验关键步骤为：先用A-F多价血清作玻片凝集，若血清发生凝集再分别选择O4 O9 O2 O10 O7等因子血清做玻片凝集，以判定其群别。

依据判定O抗原，进行H抗原第一相和第二相抗原凝集和判定，下面以某品牌血清为例进行试验。

第一步，O抗原凝集，分别取一环A~F血清和生理盐水于洁净载玻片上，挑取待检菌株新鲜培养物适量，研成乳状，倾斜摇动玻片1分钟，观察血清凝集情况。

若血清产生凝集颗粒盐水无颗粒者判为阳性；二者均无凝集颗粒产生，判为阴性；盐水有颗粒者为粗糙型菌株，不能分型。

本菌株结果为阳性。

第二步，取一环O4血清于洁净载玻片上，用和上述相同方法试验，结果若为阳性，进行H因子血清凝集试验；若结果为阴性，再分别选择O9 O2 O10 O7等因子血清进行玻片凝集试验。

本菌株O4为阳性。

第三步，H抗原凝集，在沙门菌抗原表中，选择和O4相对应H因子第一相和第二相单
因子血清作逐一凝集试验。

此次试验结果被检沙门菌抗原式为1,4,5，12：i：1,2 为鼠伤寒沙门菌。

血清凝集试验中多个特殊情况：
1.Vi抗原判定：伤寒或丙型副伤寒沙门菌Vi抗原能阻碍O抗原凝集，含丰富Vi抗原伤寒菌株，经煮沸破坏Vi抗原，再和O血清凝集。

试验方法为，取适量菌苔于1ml生理盐水中，在酒精灯火焰上煮沸后再和O血清凝集，若仍不凝集，可送上级单位判定。

2.位相诱导法试验：如双相菌只检出一相H抗原时，可用位相诱导方法取得另一相抗原。

位相诱导方法较多，关键有，小玻璃管法、小倒管法、简易平板法。

本篇着重介绍简易平板法。

将0.7%~0.8%半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取已知相因子血清一环滴在半固体琼脂平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位中央点接种待检菌株，36℃培养18~二十四小时后，在形成蔓延生长菌苔边缘取菌做凝集试验。

3.H抗原不凝集：假如两相H抗原均不出现，则应经过半固体琼脂平板、血平板等琼脂平板传代法取得某相或两相抗原
PCR检验
在沙门菌检测工作中，常利用PCR技术来做沙门菌检测初筛试验，以提升工作效率，降低成本。

PCR初筛试验采取检测样品增菌液中是否有沙门菌属侵袭性抗原保守基因（invA 基因）存在，以此来判定是否有沙门菌存在。

PCR反应条件，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环72℃延伸7min。

用凝胶成像系统观察结果时，如在284bp处出现扩增条带，则为阳性，通常PCR检测呈阳性结果标本，均应进行沙门菌病原菌检测。

注意事项
在沙门菌检验过程中，应注意以下问题。

1.试验应在BSL-2生物安全试验室二级生物安全柜中进行操作，并做好个人安全防护工作。

2.在生化初筛试验中应尤其注意，只有在三糖铁琼脂斜面和底层均产酸，同时赖氨酸脱羧酶试验阴性菌株或尿素酶阳性菌株能够排除，其它反应进行深入试验确证。

3.沙门菌判定和血清学分型试验必需使用纯化菌株。

4.BS琼脂平板要求培养观察时间为48小时，此时才能形成描述经典菌落。