当归芍药散对肾病综合征大鼠的药效学研究

当归芍药散对肾病综合征大鼠的药效学研究
戴淑娟;王运来
【摘要】目的:考察当归芍药散对肾病综合征大鼠的治疗作用及可能机制.方法:采用尾静脉注射阿霉素(6.0mg/kg)法复制肾病综合征大鼠模型,将大鼠随机分为正常组、模型组、当归芍药散全方组、活血药组、利水药组及贝那普利组,给药4周,观察尿蛋白、血清蛋白、血脂、肾功能指标变化,检测血清精氨酸加压素(AVP)、一氧化氮(NO)和尿液水通道蛋白2(AQP2)水平,探讨当归芍药散治疗肾病综合征大鼠的作用机制.结果:模型组大鼠出现典型肾病综合征症状,与模型组比较,当归芍药散组及其拆方组显著减轻大鼠24h尿蛋白,改善大鼠血清总蛋白、白蛋白含量,降低大鼠血清总胆固醇、甘油三酯水平,恢复大鼠血清尿素氮、肌酐水平,降低AVP、NO和AQP2水平(P<0.05或P<0.01).结论:当归芍药散及其拆方组可显著改善肾病综合征大鼠症状,其机制可能与降低AVP、NO和AQP2水平有关.
【期刊名称】《通化师范学院学报》
【年(卷),期】2017(038)008
【总页数】5页(P14-18)
【关键词】当归芍药散;肾病综合征;精氨酸加压素;一氧化氮;水通道蛋白
【作者】戴淑娟;王运来
【作者单位】安徽医学高等专科学校安徽合肥230061;安徽中医药大学
【正文语种】中文
【中图分类】R285.5
肾病综合征（nephrotic syndrome，NS）是由多种病因和病理类型引起的肾小
球疾病中的一组临床综合征，以大量蛋白尿、低蛋白血症、水肿和高脂血症为最基本特征.现临床主要采用利尿剂、血管紧张素转换酶抑制剂和激素治疗，但长期用
药的副作用和依赖性给患者带来较大困扰.中医学将NS归为水肿病的范畴.在《景
岳全书》曰：“肾虚则水无所主而妄行”.唐容川在《血证论》强调了“血病不离
乎水”“水病不离乎血”的观点.中医学认为肾病综合征的病因病机主要是本虚标实，脾失健运是重要的内因，导致肾气虚而不能固摄，脾虚而不能升清，从而诱发精微外泄出现尿蛋白，而瘀血作为本病的病理产物，同时亦是加重病情的重要因素，导致瘀血内停、水湿，因此，活血利水的治疗贯穿本病治疗的始终.
当归芍药散由三个活血药（当归、芍药、川芎）和三个利水药（茯苓、泽泻、白术）组成，既能滋补肾阴，又有活血利水之效，其组方精当，切合了肾病综合征的病机——脾虚血瘀水停，在临床上用于肾病综合征治疗，取得了很好的疗效［1-3］.
但是肾病综合征是一组临床症候群，发病机制有待于进一步深入地研究.本研究在
前期工作基础上，通过尾静脉注射阿霉素法复制肾病综合征大鼠模型，给予当归芍药散不同拆方组干预疾病模型，探讨当归芍药散及其拆方对肾病综合征大鼠的药效学作用.
1.1 实验动物
SD大鼠，雄性，SPF级，体重为200±20g，购于安徽省实验动物中心，合格证号：SCXK（皖）2013-002.所有大鼠进行两次尿蛋白定性试验（尿蛋白试纸法）
均为阴性.
1.2 实验药物与试剂
分别制备生药浓度为1.72g·mL-1的当归芍药散全方组药液、1.08g·mL-1活血组（当归、芍药、川芎）药液和0.64g·mL-1利水组（白术、茯苓、泽泻）药液.阿
霉素（注射用盐酸多柔比星）：山西普德药业股份有限公司（批号：02150702）；
盐酸贝那普利片：北京诺华制药有限公司（批号：X0345）.
大鼠精氨酸加压素（AVP，批号：2060118A）、大鼠水通道蛋白2（AQP2，批号：2060118A），均购于上海源叶生物技术有限公司.蛋白定量试剂盒（批号：20160122）、白蛋白试剂盒（批号：20160108）、肌酐试剂盒（批号：20160128）、尿素氮试剂盒（批号：20160120）、一氧化氮试剂盒（批号：20151225），均购于南京建成生物工程研究所.甘油三酯（批号：2016001）、总胆固醇（批号：2015035），均购于长春汇力生物有限公司.尿蛋白试纸：广州花都高尔宝生物技术有限公司（批号：20151101）.
1.3 实验仪器
MultiskanMK2酶标仪（美国Thermo Labsystems）；岛津全自动生化分析仪（日本岛津）；SZ-1型快速漩涡混匀器（江苏金成国胜实验仪器厂）；GL-16G-Ⅱ型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；UV-1800紫外分光光度计（上海箐华科技仪器有限公司）.
2.1 分组、造模及给药
48只SD雄性大鼠随机取8只作为正常组大鼠，其余大鼠在非麻醉情况下按体重6mg·kg-1一次性尾静脉注射阿霉素溶液（取阿霉素粉针剂10mg，用生理盐水充分溶解，配成2mg·mL-1溶液，现用现配），复制阿霉素肾病综合征大鼠模型，正常组给予等量生理盐水.通过尿蛋白定性试纸和考马斯亮蓝法测定24h尿蛋白含量，观察造模成功与否.若模型组24h尿蛋白定量较空白对照组大鼠升高且有统计学差异，则提示造模成功.将造模成功鼠随机分为模型组（生理盐水）、当归芍药散全方组（相当于生药17.2g·kg-1·d-1）、活血药组（10.8g·kg-1·d-1）、利水药组（6.4g·kg-1·d-1）和贝那普利组（6mg·kg-1·d-1）并给予相应的药物干预，正常对照组给予等量生理盐水.实验周期为4周.
2.2 观察指标
每周测量一次大鼠体重，观察大鼠毛发、摄食量、活动及精神状态等，并用尿蛋白试纸进行尿蛋白定性监测.于给药2周、4周末收集尿液以测定每只大鼠尿蛋白含量.
在最后一次给药的次日，处死大鼠，腹主动脉取血，4℃下3000rpm离心10min，取上清液分装，按照试剂盒说明书进行生化指标检测.检测指标有：血清一氧化氮（NO）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、尿蛋白等.采用ELISA法测定血清精氨酸加压素（AVP）和尿液水通道蛋白（AQP2）水平.
2.3 统计学分析
本次实验数据使用统计学软件SPSS 22.0进行分析，结果以“平均数±标准差”表示，两组间数据比较采用t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析.P＜0.05为差异具有显著性，P＜0.01为具有极显著差异性.
3.1 大鼠一般情况观察
采用尿蛋白试纸定性监测大鼠尿蛋白，于第3天开始出现尿蛋白，第7天尿蛋白
增加明显，造模两周后出现大量尿蛋白.造模第3天开始大鼠出现腹泻情况，造模10天最为明显.造模期间大鼠毛色暗淡凌乱无光泽、精神萎靡、喜卧少动，摄食量减少、体重降低明显.部分组别中大鼠在治疗过程中因腹泻或较强的阿霉素毒性作
用出现少量死亡情况.随着药物的进一步干预，各给药组大鼠摄食量逐步接近正常
对照组，体重缓慢增加，精神状态回升.
3.2 24h尿蛋白定量检测
造模给药2周和4周，模型组大鼠24h尿蛋白与正常对照组比较具有极显著差异（P＜0.01），表明造模成功.给药2周后，各治疗组与模型组比较，尿蛋白含量下降明显，差异具有显著性（P＜0.01）；给药4周后，各治疗组与模型组比较，差异同样具有极显著性（P＜0.01）.结果见表1.
3.3 肾功能指标的检测
与正常组比较，模型组大鼠TP、ALB含量均有显著下降（P＜0.01）；至给药4
周后，全方组、利水药组和阳性药组血清TP、ALB水平均显著高于模型组（P＜0.01）；活血药组升高总蛋白趋势明显（P＜0.05），而升高白蛋白水平具有极显著差异（P＜0.01）；当归芍药散拆方组间无明显差异.结果见表2.
与正常组相比，模型组大鼠BUN、Scr浓度均显著升高（P＜0.01）；至给药4周后，全方组、活血药组和阳性药组血清BUN、Scr浓度均低于模型组（P＜0.01）；利水药组降低BUN水平趋势明显（P＜0.05），而降低Scr水平具有极显著差异（P＜0.01）.当归芍药散拆方组间无明显差异.结果见表3.
血脂的指标结果显示，模型组TC、TG含量显著高于正常组（P＜0.01）；全方组、活血药组和阳性药组血清TC、TG浓度均低于模型组（P＜0.01）；利水药组降低TG水平趋势明显（P＜0.05），而降低TC水平具有极显著差异（P＜0.01）.全方组降低TG水平较利水药组明显（P＜0.01）.结果见表4.
3.4血清AVP、NO和尿液AQP2的检测
与正常组相比，肾病综合征大鼠血清AVP、NO和尿液AQP2水平有显著提高（P ＜0.01）；而全方组、利水药组和阳性药组治疗均可明显降低大鼠血清AVP水平（P＜0.01），活血药组治疗同样具有显著性差异（P＜0.05）；全方组、活血药
组和利水药组治疗均可显著降低血清NO水平（P＜0.01），全方组和活血药组降低程度较利水药组明显，阳性药组降低NO水平较明显（P＜0.05）；各给药组大鼠尿液AQP2水平均低于模型组，且差异具有极显著性（P＜0.01）.见表5.
阿霉素诱导动物模型是目前公认的肾病综合征动物制备模型.结合本研究的具体指标，采用6mg.kg-1尾静脉注射阿霉素可以较好地复制肾病综合征大鼠模型，但
是模型大鼠存活率不容乐观，有研究采用多次注射给药阿霉素的方式复制疾病大鼠模型，也取得了一定的效果［4］.
中医理论认为肾具固摄人体精微之功，正常人没有或仅有微量尿蛋白.肾小球滤过
膜屏障作用受损，导致原尿蛋白含量增加；当超出近曲小管回收量时，即形成大量蛋白尿，随之则会出现血中总蛋白水平下降.当脂蛋白分解能力降低和生成过剩时，则产生高胆固醇、高甘油三脂血症，引起脂代谢紊乱等［5-6］.本实验结果表明，当归芍药散具有明显地升高血清TP、ALB水平，降低TC、TG、BUN、Scr和尿
中尿蛋白含量的作用.推测其作用机制是：通过修复肾小球滤过膜功能从而降低尿
蛋白含量；通过调节肝脏蛋白的合成、降低蛋白的分解、血管外蛋白的引入等提高血清蛋白水平；改善脂代谢，抑制TC、TG的合成.提示各治疗组均能够在一定程
度上改善肾病综合征大鼠肾功能，
精氨酸加压素具有明显的抗利尿作用及收缩血管的作用.水通道蛋白2（AQP2）受精氨酸加压素（AVP）V2受体调控，经调节完成肾脏集合管对水的重吸收，从而
稳定机体水平衡［7］.AVP信号通过肾脏V2R的基本生物学特点是：水通道蛋白-2（AQP2）沿肾脏集合管到达管腔细胞表面，在外周抗利尿作用下释放AVP，促进AQP2在肾脏的转运与表达，增加水的重吸收［8］.从实验结果可以看出，肾
病综合征大鼠血清AVP、AQP2的水平较正常组显著上升，给药组大鼠血清AVP、AQP2水平明显降低.模型大鼠血清AVP水平的升高是由于肾病综合征时机体血容量下降，刺激肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）和交感神经末梢，导致Ang II的合成与分泌增加，促进AVP的合成释放而引起.当归芍药散及其拆方组是通过抑制AVP的合成与释放，从而降低AVP与集合管AVP（V2R）的结合率［9］，使集合管主细胞管腔膜上AQP2的数量大大下降，降低肾脏对水的重吸收，促进
尿液的排泄，以减轻水肿.
NO作为一种神经调节因子，其在肾脏中有诸多功能，被认为其血管通透作用导致肾病蛋白尿和水钠潴留的形成［10］.研究表明，肾病综合征患者免疫细胞产生的NO较正常人群高，血浆NO与尿蛋白水平有一定的相关性［11］.在阿霉素肾病
综合征大鼠模型中，血清NO水平和尿氮排泄升高，蛋白尿形成；一氧化氮合酶
抑制剂（aminognanidine，AG）能够有效降低尿氮排泄，抑制蛋白尿的生成［12］.本实验结果表明，不同给药组均能够降低血清NO水平，其中全方组和活血药组降低程度明显，提示各给药组可以通过改变肾病综合征大鼠血液流变学特征达到修复肾损伤的目的.
本研究结果表明，当归芍药散拆方组均可以改善上述指标的异常变化，但不同受试药物对相关指标的纠正作用差异不明显，推测当归芍药散组方中活血药和利水药均有一定的治疗作用，至于全方组药效没有优于拆方组，其可能原因与阿霉素肾病综合征模型实验周期较短有关.
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