母体游离胎儿DNA检测在筛查胎儿新发突变或父源遗传疾病的应用

【关键词】 母体游离胎儿 ＤＮＡ； 基因突变； 父源遗传疾病； 产前诊断； 软骨发育不良症； 致死性侏儒症
ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｍａｔｅｒｎａｌｆｒｅｅｆｅｔａｌＤＮＡｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｓｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒｆｅｔａｌｍｕｔａｔｉｏｎｓｏｒｐａｔｅｒｎａｌｇｅｎｅｔｉｃｄｉｓｅａｓｅｓ ＦＥＮＧＬｉｎｙｉ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｂｓｔｅｔｒｉｃｓａｎｄＧｙｎｅｃｏｌｏｇｙ，ｔｈｅＦｉｒｓｔＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＳｈａｎｘｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｘｉ０３０００１，Ｃｈｉｎａ
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ＴｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆｍａｔｅｒｎａｌｆｒｅｅｆｅｔａｌＤＮＡｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｓｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒｆｅｔａｌｄｅｎｏｖｏ ｍｕｔａｔｉｏｎｓｏｒｐａｔｅｒｎａｌｇｅｎｅｔｉｃｄｉｓｅａｓｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｗｅｓｅｌｅｃｔｅｄ２７ｐｒｅｇｎａｎｔｗｏｍｅｎ（３０３２ｗｅｅｋｓｇｅｓｔａｔｉｏｎ，ｏｒｖｉｖｉｐａｒｏｕｓ ｈｉｓｔｏｒｙｏｆｃｈｏｎｄｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａａｎｄｆａｔａｌｄｗａｒｆｉｓｍ）ｉｎｔｈｅＦｉｒｓｔＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＳｈａｎｘｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｆｒｏｍ ＪａｎｕａｒｙｔｏＤｅｃｅｍｂｅｒ ２０１７Ｔｈｅｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔｓｗｅｒｅ２０３５ｙｅａｒｏｌｄ．２ｍＬａｍｎｉｏｔｉｃｆｌｕｉｄｗａｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｂｙｕｌｔｒａｓｏｕｎｄａｍｎｉｏｃｅｎｔｅｓｉｓａｔ３０３２ｗｅｅｋｓｏｆ ｇｅｓｔａｔｉｏｎｆｏｒＤＮＡ Ｓａｎｇｅｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄ２０ｍＬｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｆｏｒｆｒｅｅｆｅｔａｌＤＮＡ ｍｕｔａｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｗｅａｎａｌｙｚｅｄｔｈｅ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌ，ｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎａｎｄｍｕｔａｔｉｏｎｓｏｕｒｃｅｓｏｆｆｒｅｅｆｅｔａｌＤＮＡ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓｉｎ２７ｍａｔｅｒｎａｌｆｒｅｅｆｅｔｕｓｅｓ（３％）ｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ１３２５ｔｏ１５８ｂｐ，ｗｈｉｃｈａｃｃｏｒｄｅｄｗｉｔｈｔｈｅｐｅａｋｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓｉｎｃｈｏｎｄｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａａｎｄｌｅｔｈａｌｄｗａｒｆｉｓｍ．ＷｈｅｎｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＤＮＡｉｎｍａｔｅｒｎａｌｆｒｅｅ ｆｅｔｕｓｅｓｗａｓ１０％，６％，３％，１％ ａｎｄ０５％，ｔｈｅｐｅａｋｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ２６０ｔｏ２７２ｂｐ，ａｎｄｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｌｅｖｅｌｏｆＤＮＡｄｏｃｕｍｅｎｔｓｍｅｔｔｈｅＰｒｏｔｏｎｓｔａｎｄａｒｄ．ＷｈｅｎＤＮＡｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓ１０％，６％ ａｎｄ３％，６ｃａｓｅｓ ｏｆｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＮＧＳｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ４ｃａｓｅｓｏｆｃｈｏｎｄｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａａｎｄ２ｃａｓｅｓｏｆｆａｔａｌｄｗａｒｆｉｓｍ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＤＮＡ Ｓａｎｇｅｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｉｎ４ｃａｓｅｓｏｆｃｈｏｎｄｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ，ｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎ ｐｅａｋａｔｃ．１１３８ｌｏｃｕｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔａｔｏｔｈｅｒｌｏｃｉ．Ｔｈｅｆｅｔｕｓｃａｒｒｉｅｄｃ．１１３８ ＞Ａｍｕｔａｔｉｏｎｇｅｎｅ，ａｎｄｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｏｒｉｇｉｎａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｆｅｔｕｓ．Ｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｐｅａｋｏｆｃ．１１３８（Ｃｈｒ４１８０６１１９）ｌｏｃｕｓｉｎ２ｌｅｔｈａｌｄｗａｒｆｉｓｍｓａｍｐｌｅｓｗａｓｌｅｓｓ ｔｈａｎ０１％．Ｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｏｒｉｇｉｎａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｆａｔｈｅｒｇｅｎｅ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＷｈｅｎｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｆｒｅｅｆｅｔａｌＤＮＡｉｓｍｏｒｅ ｔｈａｎ３％，ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍａｔｅｒｎａｌｆｒｅｅｆｅｔａｌＤＮＡｈａｓａｈｉｇｈｌｅｖｅｌｏｆｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌａｎｄａｃｃｕｒａｃｙｉｎｓｃｒｅｅｎｉｎｇｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｒｐａｔｅｒｎａｌｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅｏｆｆｅｔａｌｃｈｏｎｄｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａａｎｄｆａｔａｌｄｗａｒｆｉｓｍ，ｗｈｉｃｈｃａｎｂｅａｎａｌｏｇｉｚｅｄｔｏｐｒｅｎａｔａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｏｔｈｅｒ ｔｙｐｅｓｏｆｄｅｎｏｖｏｍｕｔａｔｉｏｎｓｏｒｐａｔｅｒｎａｌｇｅｎｅｔｉｃｄｉｓｅａｓｅｓ．
２评 估 标 准：（１）片 段 化 产 物 测 序 分 析。将 ＮＧＳ测序序 列 结 果 与 人 类 基 因 图 谱 进 行 对 比，如 ＤＧＶ、ＵＣＳＣ等数据库，获取母体游离胎儿 ＤＮＡ片 段化产物测 序 诊 断 结 果。 ＤＧＶ数 据 库 软 骨 发 育 不 良症和致死 性 侏 儒 症 波 峰 分 布 １３２５～１５８ｂｐ之 间 ［７］。（２）质 控 标 准 分 析。 ＮＧＳ测 序 测 序 完 成 后， 对测序序列进行质控，即去掉小于 １００ｂｐ的序列后 生产样本问卷，使用 ｍｔｏｏｌｓ软件进行 ｓｏｒｔ模块排序， 得到 对 应 浓 度 样 本 波 形 图 获 取 纵 轴 荧 光 ＯＤ值。 ＤＧＶ数据 库 软 骨 发 育 不 良 症 和 致 死 性 侏 儒 症 的 ＤＮＡ片 段 的 Ｐｒｏｔｏｎ标 准 区 间 为 ２００～３００ｂｐ［８］。 （３）ＮＧＳ测序突变及突变来源分析。仔细观察突变 区域，对比 ＤＧＶ数据库软骨发育不良症和致死性侏 儒症基 因 序 列 片 段，得 出 突 变 区 域 和 类 型。使 用
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中国生育健康杂志 ２０２１年第 ３２卷第 ４发育中基因突变及突变来源情况，不 仅利于在遗传学因素中查找线索，防止缺陷新生儿 的出生，也可为再次妊娠采取针对性措施提供帮助。 然而目前传统产前检测方法，如绒毛活检、羊膜腔穿 刺术等取材进行 ＤＮＡ检查，对于孕妇和胎儿均具有 一定的损伤，其导致的流产率可达 ０５％ ～１％［１］， 故寻求稳定可靠的无创伤产前基因突变检测方法是 国内外研 究 热 点 之 一。 上 世 纪 末，Ｋｈａｌｉｌ等［２］发 现 孕妇血浆中存在微量游离胎儿 ＤＮＡ，这为无创伤产 前基因突变检测带来了希望。但研究显示，母体外 周血中的游离胎儿 ＤＮＡ多在 ０３ｋｂ以下，游离胎 儿 ＤＮＡ含量较低带来的检测灵敏度低的缺点限制 了其在 临 床 上 的 应 用［３］。高 通 量 基 因 测 序 （ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ）技术是基因检测的新技 术，文献报道显示，ＮＧＳ技术辅助以 ＤＮＡ片段化处 理技术在基因染色体异常片段测序及长度测量中具 有较高的灵敏度和特异度（均可达到 ９５％以上）［４］， 这给母体游离胎儿 ＤＮＡ检测带来了技术保障。软 骨发育不全和致死性侏儒症均是胚胎发育中基因突变 后的常见骨骼疾病，年发病率分别约在 ３６～６４和 ２１～５１，６０％以上常见骨骼疾病多因纤维细胞 生长因子受体基因突变所产生，且这种基因突变具 有典型父源遗传性［５］。鉴于此，本研究以山西医科 大学第一医院妇产科近期收治的软骨发育不全和致 死性侏儒症诊断的孕妇为研究对象，采用 ＮＧＳ技术 联合 ＤＮＡ片段化处理技术对母体游离胎儿 ＤＮＡ进 行基因突变检测，并观察其在筛查胎儿新发突变或 父源遗传疾病中的应用可行性。
中国生育健康杂志 ２０２１年第 ３２卷第 ４期 ｈｔｔｐ：／／ｃｊｒｈ．ｂｊｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
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·遗传与出生缺陷·
母体游离胎儿 ＤＮＡ检测在筛查胎儿新发突变或父源遗传疾病 的应用
冯琳懿
【摘要】 目的 观 察 母 体 游 离 胎 儿 ＤＮＡ检 测 在 筛 查 胎 儿 新 发 突 变 或 父 源 遗 传 疾 病 中 的 应 用 可 行 性。 方法 选取 ２０１７年 １月—１２月期间山西医科大学第一医院孕 ３０～３２周超声提示或既往胎生史为软骨发育不良 症和致死性侏儒症的 ２７例孕妇为研究对象，孕妇年龄 ２０～３５岁，在孕 ３０～３２周超声羊膜穿刺采集羊水 ２ｍＬ行 ＤＮＡＳａｎｇｅｒ测序检测和采集外周血 ２０ｍＬ行游离胎儿 ＤＮＡ突变检测。对游离胎儿 ＤＮＡ检测的片段化产物、质控 情况、基因突变情况及突变来源情况进行分析。 结果 ２７例母体游离胎儿 ＤＮＡ（浓度 ３％）片段化产物集中 １３２５～１５８ｂｐ之间，符合软骨发育不良症和致死性侏儒症的 ＤＮＡ片段的波峰分布特征；母体游离胎儿 ＤＮＡ浓度 分别为 １０％、６％、３％、１％和 ０５％时，片段化产物波峰分布于 ２６０～２７２ｂｐ，ＤＮＡ文件质控水平符合 Ｐｒｏｔｏｎ质控标 准；母体游离胎儿 ＤＮＡ浓度分别为 １０％、６％、３％时，ＮＧＳ测序共检出 ６例基因突变，其中软骨发育不良症 ４例，致 死性侏儒症 ２例，检测结果与基因组 ＤＮＡＳａｎｇｅｒ测序突变结果吻合。４例软骨发育不良症样本，在ｃ．１１３８位点基 因突变峰明显高于其他位点，胎儿携带 ｃ．１１３８＞Ａ突变基因，突变来源于胎儿。２例致死性侏儒症样本 ｃ．１１３８ （Ｃｈｒ４１８０６１１９）位点的突变峰变化 ＜０１％，基因突变来源为父亲基因。 结论 当母体游离胎儿 ＤＮＡ浓度≥３％ 时，母体游离胎儿 ＤＮＡ检测在筛查胎儿新发软骨发育不良症和致死性侏儒症的基因突变或父源遗传性中具有较 高的质控水平和准确性，可类推到其他类型新发突变或父源遗传疾病的产前诊断。
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｍａｔｅｒｎａｌｆｒｅｅｆｅｔａｌＤＮＡ； ｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎ； ｐａｔｅｒｎａｌｇｅｎｅｔｉｃｄｉｓｅａｓｅｓ； ｐｒｅｎａｔａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓ； ｃｈｏｎｄｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ； ｆａｔａｌｄｗａｒｆｉｓｍ
作者单位：０３００１２太原，山西医科大学第一医院妇产科
二、方法 １检测方法：２７例孕妇均于孕 ３０～３２周在超
声引导下羊膜穿刺采集羊水 ２ｍＬ和外周血 ２０ｍＬ， 送实验室分别进行基因组 ＤＮＡＳａｎｇｅｒ检测和游离 胎儿 ＤＮＡ突变检测。（１）基因组 ＤＮＡＳａｎｇｅｒ检测。 采用 ＤＮＡ ＭｉｎｉＫｉｔ试剂盒 （美国公司 ＡＢＩ公司生 产）提取胎儿基因组 ＤＮＡ，采用 Ｓａｎｇｅｒ测序法行软骨 发育不良症和致死性侏儒症常见突变位点（ｃ．１１２３、 ｃ．１１３８、ｃ．１１３０）检测［６］，以此基因组 ＤＮＡＳａｎｇｅｒ测序 检测结果作为本研究金标准。（２）游离胎儿 ＤＮＡ突变 检测。首先进行母体游离胎儿 ＤＮＡ提取，标本顺序 ＩＤ编号（００００２７），离 心 血 浆 （１６００ｒａｍ／ｍｉｎ，４℃， １０ｍｉｎ），取上清 ２ｍＬ转移至无菌离心管内，采用 ＤＮＡＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＫｉｔ试剂盒（美国公司 ＡＢＩ公司生 产）提取母体游离胎儿 ＤＮＡ。（３）游离胎儿 ＤＮＡ片 段化处理。采用共聚焦超声波仪器 （型号：Ｃｏｖａｒｉｓ Ｅ２１０；生产商：澳大利亚 Ｃｃｏｒｂｅｔｔ全司）对游离胎儿 ＤＮＡ进行片段化处理，目标片段跨度 １５０～２００ｂｐ，以 ＰＣＲＣｌｅａｎＵｐ磁珠碎片化并提纯，４０μＬ缓冲液回 溶，采用 Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００生物分析仪（生产商：北京 东胜创新生物科技）对游离胎儿 ＤＮＡ 片段进行长 度测定。（４）荧光定量游离胎儿 ＤＮＡ浓度。采用 Ｑｕｂｉｔ ２０荧光定量仪（生产商：北京天根生化科 技）对游离胎儿 ＤＮＡ进行浓度定量，对应浓度按照 １０％、６％、３％、１％和 ０５％标准，采用高通量染色 体测 序 （ＮＧＳ）技 术 对 各 浓 度 荧 光 定 量 游 离 胎 儿 ＤＮＡ片段进行测序，以 １００ｂｐ为最低基因序列片段 测试长度，通 过 测 序 以 对 位 点 基 因 片 段 进 行 拍 照。 测序序列结果以文件形式保存以供评估。
资料与方法
一、一般资料 选取 ２０１７年 １月—１２月于山西医科大学第一 医 院 产 前 诊 断 中 心 就 诊 的 ２７ 例 孕 妇，其 孕 ３０～３２周超声提示或既往胎生史为软骨发育不良 症和致死性侏儒症。孕妇年龄在 ２０～３５岁，平均年 龄（２８７±２５）岁。其中超声提示或既往胎生史为 软骨发育不良症就诊孕妇 １９例，致死性侏儒症就诊 ８例。纳入研究 的 孕 妇 及 配 偶 身 体 健 康，自 身 无 软 骨发育不良症或致死性侏儒症，无妊娠期高血压、糖 尿病、脂肪肝等妊娠期合并症或并发症，肝肾功能正 常，无妇科疾病。本研究所有孕妇及家属对研究知 情且签订同意书。