碳源对加纳链霉菌合成默诺霉素的影响

碳源对加纳链霉菌合成默诺霉素的影响
车阳;赵春田;裘娟萍
【摘要】通过摇瓶发酵测定加纳链霉菌发酵曲线以及补料前后默诺霉素合成基因转录水平分析,寻找适宜默诺霉素合成的补料碳源.结果发现,发酵至84 h,发酵液中残糖含量最低,在该时刻补加一定浓度碳源,测定效价可知,高浓度葡萄糖和蔗糖对默诺霉素的合成具有抑制作用,补加0.5％蔗糖能有效促进默诺霉素的合成,转录水平分析发现蔗糖的补加促进了默诺霉素合成相关基因的转录,默诺霉素效价提高14.3％.蔗糖的补加有助于促进默诺霉素生物合成中相关底物的合成,从而提高了默诺霉素发酵水平.
【期刊名称】《浙江农业学报》
【年(卷),期】2015(027)008
【总页数】7页(P1355-1361)
【关键词】默诺霉素;加纳链霉菌;碳源;蔗糖;转录分析
【作者】车阳;赵春田;裘娟萍
【作者单位】浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州310014;浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州310014;浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州310014
【正文语种】中文
【中图分类】S859.79+6;Q939.9
默诺霉素(Moenomycin) 又称黄霉素(Flavomycin)，属于磷酸糖脂类抗生素。

它通过影响畜禽肠道细菌的滋生，改善动物肠道对营养物质的吸收，从而促进动物生长。

默诺霉素具有几乎不被动物吸收、毒性较低、排泄迅速、不易残留等优点，作为一种动物促生长剂被广泛使用[1]。

默诺霉素于1965年首次被发现[2]，至少有4种链霉菌可产生默诺霉素[3]。

它能有效抑制革兰氏阳性菌，其抑菌效果是万古霉素的10～1 000倍[4]，但由于其半衰期长，口服不易吸收等药代动力学特性限制了它的临床使用，所以目前国外的研究主要集中在通过分子遗传学或者化学的手段寻找默诺霉素的结构类似物，以期望改变其药代动力学特性并保留其抑菌效果[5-6]，而国内的研究主要集中在默诺霉素对各种动物的影响以及高产菌株的选育[7-8]。

默诺霉素作为一种复合抗生素首次分离于班堡链霉菌(Streptomyces bambergiensis)的发酵液中，其中默诺霉素A为主要成分。

默诺霉素A由一个戊多糖、一个磷酸甘油酸和一个C25脂链构成，默诺霉素合成基因簇中有5个基因负责默诺霉素合成过程中糖基的转移，参与合成默诺霉素的碳源主要是UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GlcUA)和UDP-N-乙酰糖醛胺(UDP-GlcNAc)，合成关键代谢途径见图1。

吴海燕[9]的研究表明，默诺霉素产生菌之一的班堡链霉菌对蔗糖、乳糖利用率不高，用葡萄糖作为碳源，菌丝生长良好，但对默诺霉素合成不利；以淀粉作为碳源，菌丝生长较旺盛，默诺霉素产量高，说明碳源种类影响默诺霉素戊多糖的结构的形成，将是提高产量的有效途径。

本文通过摇瓶补料的方式，寻找加纳链霉菌合成默诺霉素最佳碳源，通过相关基因转录水平的测定，探究蔗糖提高默诺霉素产量的原因。

1.1 材料
1.1.1 菌种
加纳链霉菌(Streptomyces ghanaensis) 由浙江工业大学微生物实验室保藏。

1.1.2 培养基
斜面固体培养基(YMS)：可溶性淀粉4 g·L-1，麦芽浸粉10 g·L-1，酵母膏4 g·L-1，CoCl2·6H2O 0.005 g·L-1，琼脂15～20 g·L-1，pH值7.2～7.5(消化前)，115℃灭菌30 min。

种子培养基：玉米浆干粉1.7 g·L-1，豆粕粉30 g·L-1，葡萄糖40 g·L-1，
K2HP4·3H2O 1 g·L-1，CaCO3 2.5 g·L-1，pH值7.0～7.2(消化前)，115℃高压灭菌30 min。

发酵培养基[10]：玉米浆干粉9 g·L-1，豆饼粉30 g·L-1，玉米淀粉40 g·L-1，大豆油40 g·L-1，K2HPO4·3H2O 1 g·L-1，KH2PO4 2 g·L-1，MgSO4·5H2O 0.5 g·L-1，CaCO3 5 g·L-1，pH 7.0～7.2(消前)，115℃高压灭菌30 min。

1.1.3 引物及其序列
引物及其序列见表1。

1.2 主要仪器
高效液相色谱仪LC-20A(日本岛津公司)，YS100型光学显微镜(日本Nikon公司)，紫外可见光分光光度计(上海棱光公司)，TE612-L型分析天平(北京赛多利斯有限
公司)，荧光定量PCR仪CFX96(美国伯乐公司)，超微量紫外分光光度计(Bioteke ND5000)。

1.3 主要试剂
Diethy pyrocarbonate(阿拉丁公司)，RNAiso Plus(TaKaRa公司)，PrimeScriptTM RT Master Mix和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司)，
蔗糖(广东省化学试剂工程技术研究开发中心)。

1.4 方法
1.4.1 培养条件
斜面培养条件：挑取加纳链霉菌单菌落在斜面上划线，30℃恒温培养8 d。

一级种
子培养条件：取无菌水加入斜面，将加纳链霉菌菌丝刮下倒入一级种子培养基，装量50/250 mL三角瓶，摇床转速230 r·min-1，36℃培养48 h。

二级种子培养条件：二级种子培养基，装量100/500 mL三角瓶，接种量7%，摇床转速230 r·min-1，36℃培养24 h。

发酵培养条件：发酵培养基，装量50/250 mL三角瓶，接种量6%，摇床转速230 r·min-1，36℃培养9 d。

1.4.2 默诺霉素效价测定
采用HPLC方法测定默诺霉素的效价[9-10]
1.4.3 还原糖的测定
采用3，5-二硝基水杨酸比色法[11]。

1.4.4 链霉菌总RNA提取
取500 μL菌液离心得菌体，加入1 mL RNAiso Plus，剧烈震荡使菌体混匀，静置，离心，上清液加入200 μL氯仿，剧烈震荡静置，离心；取上清加入500 μL
异丙醇，轻轻混匀，静置，离心；取沉淀用75%乙醇洗涤，挥干乙醇，加入一定
量DEPC水。

1.4.5 荧光定量PCR分析
取500 ng总RNA与反转录酶和随机引物混合，用PrimeScriptTM RT Master Mix进行反转录，方法同说明书。

荧光定量PCR参数设置如下：95℃预变性30 s，接着40个两步扩增循环(95℃变性 30 s；60℃ 30 s 退火和延伸)。

基因的相对表
达量分析采用2-△△Ct的方法[12](以hrdB基因作为内参基因进行校正)，Ct表示
当荧光值达到检测阈值时的循环数。

1.5 试验数据统计方法
利用Excel统计分析软件对试验数据均值进行分析，数据处理后用Origin 8.0绘图。

所有试验均重复3次或以上，结果以均值和标准误差表示。

2.1 加纳链霉菌发酵过程的糖代谢曲线
将加纳链霉菌按照1.4.1节方法进行培养，定时取样，分别测定发酵液中的还原糖、总糖、默诺霉素产量等参数，结果见图2。

由图2可见，发酵初期菌体生长快，可迅速利用培养基中的总糖、还原糖。

培养至84 h，培养基中还原糖与总糖均降至
最低，此时菌体开始迅速合成默诺霉素，总糖含量为15.5 g·L-1，还原糖含量为1.3 g·L-1。

因此，选择84 h作为碳源补料时间。

2.2 补加葡萄糖对默诺霉素的影响
在84 h分别补加浓度为0%，0.5%，1.0%，1.5%的葡萄糖，发酵至9 d测定默
诺霉素效价，结果见图3。

图3显示，默诺霉素的合成受到葡萄糖的阻遏作用，补加0.5%，合成就受到抑制，因此需要筛选能促进默诺霉素合成的补料碳源。

2.3 默诺霉素合成中补加碳源的选择
将加纳链霉菌发酵至84 h，取样测定默诺霉素效价，同时分别补加与0.5%葡萄糖相同含碳量的麦芽浸粉、玉米粉、蔗糖、玉米淀粉、可溶性淀粉、乳糖、半乳糖，继续发酵24 h后，取样测定默诺霉素的效价，计算24 h产默诺霉素速率，结果
见表2。

继续发酵至9 d测定默诺霉素效价，研究不同碳源对抗生素合成的影响。

CK补加相同体积无菌水，结果见图4。

由图4可见，补加乳糖、蔗糖和麦芽浸粉能促进默诺霉素的合成。

由表2可见，
补加蔗糖对默诺霉素的合成具有明显的促进作用，而补加玉米粉、麦芽浸粉、玉米淀粉则明显抑制默诺霉素的合成。

因此，选择蔗糖作为默诺霉素发酵过程中补料碳源。

2.4 蔗糖补加浓度对默诺霉素合成的影响
将加纳链霉菌按照1.4.1节方法发酵至84 h，分别补加蔗糖至终浓度为0%，
0.25%，0.50%，0.75%，1.00%，1.25%，发酵至9 d测定默诺霉素效价，结果
见图5。

图5显示，当蔗糖补加量大于0.75%时，对默诺霉素合成有一定抑制作
用。

当蔗糖补加量为0.50%时，对默诺霉素合成有一定促进作用。

2.5 蔗糖补加时间对默诺霉素合成的影响
将加纳链霉菌按照1.4.1节方法发酵至72，84，96，108，120 h时，补加蔗糖，发酵至9 d测定默诺霉素效价，结果见图6。

图6显示，发酵72～108 h补加蔗糖，对默诺霉素的合成均有促进作用，其中最佳补加时间为发酵84 h，此时默诺
霉素效价可提高14.3%。

2.6 补加蔗糖对默诺霉素合成相关基因转录水平的影响
为探究蔗糖的添加促进默诺霉素合成的机制，将加纳链霉菌按照1.4. 1节方法发
酵至84 h补加0.5%蔗糖，CK补加相同体积无菌水，取补加蔗糖后0，24，48 h 的发酵液提取其总RNA，荧光定量PCR分析6个默诺霉素合成相关基因的转录水平，以hrdB基因为内参。

结果见图7。

图7所示，相较于CK，moeE5，yngB
的转录水平明显增加，且补加48 h后促进作用依然较大；moeX5，moeGT2，glmU 3个基因在补加蔗糖24 h后转录水平均有所增加，48 h后随着蔗糖被菌体利用，转录的促进作用变小；而ugdH的转录水平在补加蔗糖24 h时几乎不变，补加蔗糖48 h后ugdH转录水平却明显增高。

默诺霉素作为一种动物促生长剂，具有对动物无毒害、对环境无污染、性能稳定、用量少、促生长效果突出、不易产生耐药性、配伍禁忌少等特性，所以被广泛用作动物饲料添加剂[1]。

本文通过在发酵过程中补加碳源，促进默诺霉素的合成，并
通过转录水平分析，初步探索蔗糖促进默诺霉素合成的机理。

在默诺霉素合成基因簇中，moeE5，moeX5，moeGT2直接参与默诺霉素合成、转运及默诺霉素合成过程的糖基转移[13]，其中moeE5编码一差向异构酶，催化UDP-葡萄糖醛酸异构形成UDP-半乳糖醛酸；moeX5和MoeP5一起编码ATP-
依赖型运输系统，Ⅰ型ABC转运蛋白；moeGT2编码糖基转移酶，转移默诺霉素A合成过程中最后一个糖环，即D-葡萄糖醛酸。

补加蔗糖能促进默诺霉素合成基
因簇中和糖基合成与转移以及与默诺霉素转运相关基因的转录，从而提高默诺霉素的产量。

默诺霉素合成起始于UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰糖醛胺，yngB 编码UTP-
葡萄糖-1-磷酸尿苷基转移酶，参与合成UDP-葡萄糖，UDP-葡萄糖再通过ugdH 基因编码的UDP-6-葡萄糖脱氢酶生成UDP-葡萄糖醛酸。

补加蔗糖24 h，试验组yngB基因的转录水平明显增加，而ugdH则在补料48 h时转录水平明显增加，这说明蔗糖的补加直接促进UDP-葡萄糖的合成为先，而后由于UDP-葡萄糖浓度的增加促进了UDP-葡萄糖醛酸合成。

glmU编码一种双功能酶参与UDP-N-乙酰糖醛胺合成，补加蔗糖后glmU转录水平分析结果显示，发酵过程中补加蔗糖N-乙酰糖醛胺合成基因转录，从而促进默诺霉素合成。

补加蔗糖后，moeE5，moeX5，moeGT2，yngB，glmU转录水平都明显增加，但是24 h相对效价增加值只有12.91%，与CK相比只增加了1.19%，可能是由
于moeE5，moeX5，moeGT2基因并不参与默诺霉素A生物合成的最后一步，瞬时的转录水平提高后需要其他基因的反馈从而促进默诺霉素A的合成，表明转
录水平的变化与默诺霉素合成存在一定的迟效性，而yngB与glmU与初级代谢
相关，合成的产物并不全部参与默诺霉素的合成。

*通讯作者，裘娟萍，E-mail：*****************.cn
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