应用SCoT标记分析玄参种质资源的遗传多样性

应用SCoT标记分析玄参种质资源的遗传多样性
［摘要］目的：研究玄参种质资源的遗传多样性及亲缘关系。

方法：应用目标起始密码子多态性（SCoT）技术对来源于全国各地的48份玄参种质进行遗传多态性分析。

遗传距离采用TREECONW软件计算，UPGMA方法构建亲缘关系树状图。

结果：28条引物共检测到279个位点，其中214个为多态位点，占76.7%。

遗传距离变化范围在0.1507～0.4933。

聚类结果显示栽培玄参亲缘关系较为复杂：有的种质具明显的地理相关性；有的种质聚类混杂，与地理分布无明显相关性；也有来源于同一地区的种质仅部分聚在一起，呈现出一定的地域性分布规律。

结论：栽培玄参的遗传多样性水平较高，为优良品种的培育提供了丰富的遗传基础。

［关键词］玄参；SCoT；种质资源；遗传多样性
1材料
玄参采自四川、重庆、陕西、湖北、浙江等主产地，共48份材料（表１）。

根据均匀分布、随机取样的原则，在每个栽培群体中选取10个单株，尽量覆盖该群体的分布范围。

在每一单株上采集新鲜幼嫩的叶片，洗净、晾干后，放入装有硅胶的自封袋，快速干燥。

Gel Doc XR凝胶成像系统（BIORAD）、S1000TM Thermal Cycler热循环仪（BIORAD）、Smart SpeeTM3000型分光光度计（BIORAD）、DYCP34A 琼脂糖水平电泳槽（北京市六一仪器厂）、DYY6C型电泳仪（北京市六一仪器厂）。

SCoT引物（由上海生工合成）、Trans2K Plus DNA Marker（北京全式金）、DNA提取试剂盒（北京天根）、Taq酶（TOYOBO）、dNTPs（北京鼎国）、SYBR Green核酸染料（北京鼎国代理）、琼脂糖（进口分装）、其余为国产分析纯试剂。

2方法
2.1玄参基因组DNA提取每个产地玄参材料等量混合，用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的样品的完整性，并用紫外分光光度计测定其浓度和纯度，将样品稀释标定到40mg·L-1，置于-20℃条件下保存备用。

2.2SCoTPCR扩增与检测SCoT引物参照Collard和Mackill[1]开发的引物，由上海生工生物工程有限公司合成。

从供试材料中随机抽取2个DNA模板对36条SCoT引物进行筛选，最终确定28条扩增产物清晰、重复性好且多态性条带相对较高的引物用于正式PCR扩增。

SCoT反应体系：总体积25μL，内含1×PCR buffer，1.5mmol·L-1
Mg2+，200μmol·L-1dNTP，0.4μmol·L-1引物，40ng模板，1U Taq DNA聚合酶。

扩增程序为94℃预变性4min，然后进行36个循环：94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，循环结束后72℃延伸10min，4℃保存。

在1×TAE缓冲系统下，扩增产物加入核酸染料在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳分离，电压150V。

当溴酚蓝指示剂距离琼脂糖凝胶前沿约2～3cm时停止电泳，在凝胶自动成像系统上照相并记录扩增情况。

2.3数据的统计与分析对扩增清晰且易于辨认的条带根据其迁移率及有无统计所有的二元数据，有带（显性）记为1，无带（隐性）记为0，从而形成SCoT标记的0，1二维数字矩阵。

利用TREECONW分析软件（版本1.3）计算材料间遗传距离，按UPGMA方法构建分子系统树。

3结果与分析
3.1SCoT多态性分析从36条SCoT引物中筛选出扩增谱带清晰并呈现多态性的引物28条，对供试的48份玄参资源进行SCoTPCR扩增和电泳检测，结果显示扩增条带清晰，每条引物的扩增片段绝大多数集中在250～2000 bp，以500～2000bp居多。

SP5的扩增图谱见图1。

28条引物共扩增出279个位点，其中214个位点具有多态性，占总位点的76.7%，每条引物的多态百分率变幅为42.86％～100.00％，多态性最高的是引物SP5，SP32，均达到l00.00％，多态性最低的是引物SP25，为42.86％；每条引物可扩增出的位点数为6～15个，平均9.96个；多态性位点3～14个，平均7.64个，见表2。

说明供试玄参资源的遗传多样性较为丰富。

3.2遗传距离分析用TREECONW软件计算供试材料间的遗传距离。

结果表明48份玄参种质的遗传距离介于0.1507～0.4933，平均为0.3346。

重庆武隆仙女山龙宝塘大湾（3）与四川绵阳市北川县擂鼓乡田坝村（26）之间的遗传距离最大，表明亲缘关系最远；重庆南川浙玄参（16）与重庆酉阳腴地（17）之间遗传距离最小，表明亲缘关系最近。

3.3聚类分析用UPGMA法构建立48份玄参种质的分子系统树，见图2。

48份玄参种质首先聚为2大类（Ⅰ和Ⅱ）：第Ⅰ大类最为混杂，包括来源于重庆、湖南、湖北、陕西、贵州、浙江的41份种质；第Ⅱ大类较为简单，来源于四川的7份种质全部聚在此大类中。

第Ⅰ大类可分为2个亚类（A和B）：B 亚类中的3份种质分别来自重庆石柱黄水（23）、湖北利川团堡兴隆坪（37）和湖南（47）；A亚类又可细分为Aa，Ab，Ac3个小类，其中Aa类中较为混杂，包括24份种质，Ab类的5份全部为湖北种质，Ac类的9份种质均来源于重庆南川。

从以上聚类结果可以看出，玄参种质之间的亲缘关系比较复杂：有的种质具明显的地理相关性，如四川的7份种质独自聚为1类（Ⅱ），明显区别于其他种质；有的来源于同一地区的种质仅部分聚在同一类，呈现出一定的地域性分布规律，如7份湖北种质中有5份独自聚为1类（Ab）、重庆南川的11份种质中有9份独自聚为1类（Ac）；有的种质虽然聚在同一小类中，但较为分散，如
重庆武隆的5份种质（1，2，3，4，5）、陕西种质（39，40，41，42），重庆酉阳的4份种质（17，18，19，20）；有的种质较为混杂的聚为1类，如Aa类中的24份种质来源于重庆，湖南，湖北，陕西，贵州，浙江；有的种质聚类无地理相关性，如B亚类中的3份种质。

4讨论
随着分子标记技术的发展，植物种质资源遗传多样性的评价已不再局限于形态学、细胞学及生化标记，RAPD，SSR，ISSR，AFLP，SRAP及新近开发的SCoT分子标记技术已广泛应用于植物种质资源的遗传多样性检验。

前4种标记都是传统意义上的随机分子标记，得到的标记一般与目标性状基因相距较远，而后2种标记为目的基因分子标记，得到的位点可能是目的基因的一部分或与目的基因紧密联锁，更利于分子标记辅助育种。

由于每种分子标记针对基因组不同区域进行扩增，其多态检测效率也各不相同。

从SCoT标记对水稻、花生、龙眼等物种的遗传多样性分析结果看[12，4]，SCoT单引物扩增可获得丰富的多态性条带。

就玄参而言，种质资源的分子评价研究较少，仅见于本院陈大霞等[11]采用SRAP标记检测玄参3种栽培类型的遗传多样性。

目前为止，尚未见采用SCoT新型标记探讨玄参遗传多样性的研究报道。

基于SRAP标记揭示的玄参3种栽培类型遗传多态性：在物种水平上，多态位点百分率为52.42%，而在栽培类型水平上，多态位点百分率平均仅为21.44%，且栽培类型间的遗传差异大于栽培类型内的遗传差异，即大部分遗传变异存在于栽培类型间[11]。

本试验应用筛选到的28条SCoT引物能在48份栽培玄参资源中检测到较丰富的遗传多态性，平均多态率达到76.7%，高于基于SRAP标记揭示的玄参3种不同栽培类型间的多态率。

虽然SRAP标记与SCoT标记都是目的基因分子标记，均可用于基因表达差异分析，但SCoT的多态检测效率高于SRAP标记，能揭示较多玄参种质间的遗传差异，因此，SCoT标记更适用于玄参种质资源遗传多样性的分子评价及下一步的分子辅助育种。

本文供试材料来源于全国玄参主产地，类型多样，材料间在玄参植株株高、生育期、叶片形状等外部形态上具有较丰富的表型性状多态性。

在实地调查中发现，四川北川、宝兴的玄参种质没有混杂外来种源，为当地农民保留的本地种，在叶片形态及叶片着生的角度上具有独特的种质性状，明显的聚为一类，表明其亲缘关系较近。

从聚类结果还可以看出，有的种质虽然来源于同一地区，但并未聚在一起，而有的种质地理距离相隔较远却聚在同一类中。

聚类结果显示栽培玄参种质之间的亲缘关系较为复杂，出现这一结果的原因可能是与玄参种质具有相似的生长环境有关。

玄参易种易管，适宜种植地区广泛，相似的小生境必然导致遗传基础的相似性；与相同的选择标准有关，玄参生产上历来采用子芽进行无性繁殖，药农在长期的栽培过程中，十分注重选种，而选择标准大多侧重于产量这一经济性状，因此强大的选择压力导致栽培玄参在遗传上或多或少具有相同的遗传背景；与地区间频繁的引种现状有关。

我国玄参引种驯化和人工栽培历史悠久，始于近代，产地十分广泛。

近年来，浙江一带经济结构发生巨大变化，种植面积急剧减少，使得玄参种植基地发生转移。

如重庆武隆县、南川区已发展为玄参的主产区之一，最初的玄参种源是20世纪60年代末从浙江引入，但随着种植面积的扩大，现有的种源难以满足扩大生产时，也从周边地区引种。

此外，地区之间的相互引种也相当频繁，各玄参主产区的种源都相当混杂。

种质来源的复杂性使得遗传距离与地理来源地无明显相关性，本研究从分子水平上印证了这一结果。

因此栽培玄参种质间的亲缘关系不完全是自然演变的结果，过多的人为引种也是原因之一。

综上所述，针对我国栽培玄参的遗传多样性特点及种质间亲缘关系的复杂性，在建立种质资源圃时需要考虑不同地理来源及不同的生态型，尽可能多的收集不同的居群和单株。

同时，既要考虑产量这一主要经济性状，也要考虑抗性等其他性状，才能最大限度地覆盖玄参的基因库，保存尽可能多的遗传多样性，为下一步优良品种的选育奠定物质基础。

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