优化高效液相色谱法对水产品中4种氟喹诺酮类药物残留的检测

优化高效液相色谱法对水产品中4种氟喹诺酮类药物残留的
检测
兰承兴;田雪莲;周开拓;李雪林;甘大勇
【摘要】为同时测定水产品中4种氟喹诺酮类药物(环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、沙拉沙星)的残留量,对高效液相色谱法进行优化,样品采用酸化乙腈提取,正己烷脱脂.结果:采用流动相2 mL进行洗脱,流动相乙腈:四丁基溴化铵溶=7:93,4种氟喹诺酮类药物在0.001～0.1μg/mL线性关系良好,相关系数均>0.999;在10～
40μg/kg加标浓度下,回收率为72.40％～83.68％,相对偏差(RSD)为1.30％～6.94％.结果表明:优化后的方法回收率高,重复性和分离效果好,能够用于水产品中氟喹诺酮类药物残留检测.
【期刊名称】《贵州畜牧兽医》
【年(卷),期】2018(042)002
【总页数】5页(P25-29)
【关键词】水产品;氟喹诺酮;残留;高效液相色谱;优化
【作者】兰承兴;田雪莲;周开拓;李雪林;甘大勇
【作者单位】贵州省福泉市农村工作局,贵州福泉 550500;贵州省福泉市农村工作局,贵州福泉 550500;贵州省福泉市农村工作局,贵州福泉 550500;贵州省福泉市农村工作局,贵州福泉 550500;贵州省福泉市农村工作局,贵州福泉 550500
【正文语种】中文
【中图分类】S859.84
氟喹诺酮(Fluoroquinolones，FQS)是一类人工合成的新型抗菌药物，具有抗菌作用强、抗菌谱广、高效、低毒、半衰期较长、用药次数少等特点，被广泛应用于畜禽和水产养殖业[1，2]。

水产养殖中大量使用氟喹诺酮类药物残留的风险相对较大，长期食用含有氟喹诺酮类药物的食品可使病原菌产生耐药性，甚至会引起人体的变态反应，已引起人们的高度关注[3]。

因此，开展水产品中氟喹诺酮类药物残留检测，对监控水产品质量，保障人民的食品安全具有重要作用。

目前，关于水产品中氟喹诺酮类检测的报道较多，主要采用微生物法、高效液相色谱法、高效毛细管电泳分析法、液相色谱-质谱联用法、免疫分析法等[4]。

每种方法各有特点，适用于不同的要求和目的。

各县(市)级农产品质量安全检测站用于检测水产品中氟喹诺酮类药物残留的方法主要为高效液相色谱法，而在已有的标准中能够用高效液相色谱法检测的仅有《水产品中诺氟沙星、盐酸环丙沙星、恩诺沙星残留量的测定液相色谱法》(农业部783号公告-2-2006)[5]。

通过试验及李佩佩[6]的研究表明，该标准方法存在浓缩中旋蒸不易蒸干，加标回收峰偏移较大等问题。

本研究以该标准为基础，通过改变流动相比例、洗脱体积等进行优化，以期为县(市)级农产品质量安全检测站开展水产品中氟喹诺酮类残留测定提供参考。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试样本：供试鱼均购自农贸市场，经检测均不含4种氟喹诺酮类药物。

1.1.2 试剂：环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、沙拉沙星标准溶液(农业部环境保护科研监测所，浓度为100 μg/mL)；乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司)；正己
烷(西陇化工股份有限公司)；四丁基溴化铵(摩贝生物科技有限公司)；盐酸、磷酸、无水硫酸钠(上海一研生物科技有限公司)；酸化乙腈(乙腈∶50%盐酸=250∶2)；
四丁基溴化铵溶液(取四丁基溴化铵3.22 g，用水定容至1 000 mL，用磷酸调pH
值至3.1)。

1.1.3 仪器：Agilent 1220液相色谱(配荧光检测器，美国安捷伦公司)、Scout SE 电子天平(奥豪斯仪器有限公司)、XW-80A涡旋震荡混合器(上海精科实业有限公司)、HY-1振荡器(常州国华电器有限公司)、TGL 16M离心机(长沙迈佳森仪器设
备有限公司)、0.45 μm滤膜。

1.2 方法参照《水产品中诺氟沙星、盐酸环丙沙星、恩诺沙星残留量的测定液相
色谱法》(农业部783号公告-2-2006)。

1.2.1 色谱条件：(1)C18 (250 mm×4.6 mm)色谱柱；(2)流动相：四丁基溴化铵溶：乙腈=95∶5(V∶V)；(3)流速：1.5 mL/min；(4)柱温：40 ℃；(5)进样量20 μL；(6)荧光检测器激发波长280 nm，发射波长450 nm。

1.2.2 提取：准确称取样品5 g，依次加入无水硫酸钠30 g，酸化乙腈30 mL，匀浆，将匀浆样品置于带玻璃珠的三角瓶中(2～3粒/瓶)，经摇床振荡15 min，再
转入离心管中，10 000 r/min离心10 min，取上清液。

残渣中加入酸化乙腈30 mL，重复2次，合并上清液。

1.2.3 净化与浓缩：将上清液置于分液漏斗中，加入正己烷25 mL，振荡5 min，充分静置，取下层乙腈层移入烧瓶，55 ℃旋转蒸发至干。

用流动相1.0 mL分2
次溶解残渣，移入10 mL离心管，10 000 r/min离心5 min，取上清液，过膜，待测定。

1.2.4 标准曲线绘制：准确吸取适量环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、诺氟沙星标准工作液，用流动相稀释成浓度为 0.001、0.01、0.05、0.10、0.50 μg/mL 的标准溶液。

以标准品浓度为横坐标，色谱图中对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.5 回收率测定：取鱼肉样品5.00 g，按照20 μg/kg的添加量添加 4 种标准品进行优化，按照10、 20、40 μg/kg水平下进行回收率与精密度试验，按上述条件进行测定，每个样品平行测定3次，计算样品的加标回收率。

2 结果
2.1 优化色谱条件采用“农业部783号公告-2-2006”的流动相比例进行高效液相色谱分析，发现加标回收中由于基质及pH值的影响峰形偏移较大，导致4种药物校不准。

本研究将流动相进行调整，以乙腈∶四丁基溴化铵溶=5∶95、6∶96、7∶93(V∶V)3个不同比例的流动相进行试验，结果表明7∶93时峰形偏移最小，仪器响应值较高，能达到实验要求。

因此，以乙腈∶四丁基溴化铵溶=7∶93优化后的色谱条件。

图1为该条件下4种氟喹诺酮类在0.1 μg/mL下的色谱图。

表1为该条件下的回归方程和线性范围，可见4种氟喹诺酮类药物浓度和峰面积在0. 001～0.1 μg/mL呈现良好的线性关系，相关系数均大于0.999。

2.2 优化洗脱体积对药物回收率的影响通过前期实验发现，采用1 mL的流动相进行洗脱，药物回收率较低，恩诺沙星达不到标准要求的70%～80.5%。

为了将目标物尽可能多地洗脱出来，分别采用1、 2、 3 mL 的流动相进行洗脱。

从表2可见，回收率随着洗脱体积的增大呈递增趋势，提取体积分别为1、 2、 3 mL，诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星的回收率分别为7
3.15%～79.05%、67.30%～76.35%、68.30%～80.15%、71.25%～8
4.20%。

当洗脱体积为3 mL 时，4种氟喹诺酮类药物的回收率均最高，但考虑到采用2 mL洗脱已能够全部满足标准要求的回收率要求，而采用3 mL洗脱体积对检出限的影响较大，因此将流动相洗脱体积2 mL作为优化后的洗脱体积。

图1 4种氟喹诺酮类药物标准品在0.1 μg/mL下的色谱图表1 4种氟喹诺酮类药物回归方程和线性范围
药物回归方程相关系数线性范围(μg/mL)诺氟沙星 y=115.50x-0.130.9991 0.001～0.1环丙沙星 y=87.31x-1.460.9995 0.001～0.1恩诺沙星
y=190.28x-1.060.9990 0.001～0.1沙拉沙星 y=55.77x-0.430.9995 0.001～0.1
表2 优化洗脱体积对药物回收率的影响药物洗脱体积(mL)加标浓度(μg/kg)实测浓度(μg/kg) 平均回收率(%) 相对标准偏差(%)诺氟沙星12014.63 73.15
4.362201
5.47 77.35 2.7032015.81 79.05 1.41环丙沙星12013.46 67.30
6.0322014.98 74.90 2.5032015.27 76.35 5.83恩诺沙星12013.66 68.30 4.5722015.45 7
7.25 2.2232016.03 80.15 1.09沙拉沙星12014.25 71.25 7.4822016.69 83.45 5.3732016.84 84.20 6.25
2.3 药物回收率与精密度试验分别取鱼肉 5.00 g进行加标回收试验，添加浓度分别为0.05、0.1、0.2 μg/mL 的4种氟喹诺酮标准溶液各1.0 mL，按照上述优化的流动相比例及洗脱体积进行药物回收率与精密度试验，回收结果见表3。

从表3可见，在10～40 μg/kg添加浓度下，除环丙沙星外，其余均随添加浓度的增加回收率水平有所提高，4种氟喹诺酮类药物的回收率均能达到标准要求，相对偏差(RSD)为1.30%～6.94%，精密度较好。

鱼肉中4种氟喹诺酮类药物的空白色谱图见图2。

0.1 μg/mL浓度下加标色谱图见图3。

表3 不同浓度下4种氟喹诺酮类药物的添加回收率药物添加含量(μg/kg)实测平均含量(μg/kg)平均回收率(%) 相对标准偏差(%)诺氟沙星107.3173.10
3.542015.3676.80 1.304033.4783.68 2.67环丙沙星107.8378.30
1.632015.4277.10 5.744030.8677.15 5.66恩诺沙星107.4374.30
6.942015.7778.85 4.824032.0480.10 5.58沙拉沙星10
7.2472.40
3.72201
4.6873.40 3.244030.6776.68 4.27
图2 水产品中4种氟喹诺酮类药物的空白色谱图
图3 20 μg/kg浓度下4种氟喹诺酮类药物回收色谱图
3 结论与讨论
3.1 本研究以“农业部783号公告-2-2006”为基础，对检测鱼肉中的氟喹诺酮类药物残留方法进行优化及确认，发现因为氟喹诺酮类药物具有酸碱两性，其色谱峰
容易拖尾，流动相乙腈∶四丁基溴化铵溶液=7∶93，pH值为3.1时峰形分离较好，响应值高。

陈丽等[7]的研究为流动相乙腈∶四丁基溴化铵溶液=3∶97，pH值为2.4的0.01 mol/L四丁基溴化铵溶液时分离好。

说明在检测过程中pH值、流动
相比例不是唯一不变的，通过适当调整也能达到效果。

但是在试验中，pH值一定要统一，配标液的流动相与上机检测的流动相pH值要一致，否则容易导致样品中氟喹诺酮类药物峰形的偏移，无法对样品定量。

3.2 洗脱液及体积是影响药物回收率的重要影响因素之一，本研究分别采用洗脱液1、 2、 3 mL进行试验，确定采用洗脱液2 mL能够达到回收率及定量限要求，
这是首次报道可通过改变洗脱体积来提高回收率。

李佩佩等[6]通过简化该标准的
前处理，优化色谱条件使该标准回收率高，检出限低，说明同一标准可以从不同过程进行优化，使标准能够为检测工作者提供参考，为检测水产品中氟喹诺酮类药物提供支持。

参考文献：
[1] 田茂军，彭敬东，张晶.分散液液微萃取-高效液相色谱法测定蔬菜中氟喹诺酮
类药物残留[J].西南师范大学学报(自然科学版)，2016，41(1)：40-44.
[2] 姜兴华，杨韶芸，沈荣明.高效液相色谱法测定鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物的含量[J].食品安全质量检测学报，2016，7(12)：4978-4981.
[3] 康莉，李勇，陈春晓，等.水产品中多种氟喹诺酮类药物残留的HPLC测定法[J].职业与健康，2008，24(2)：119-121.
[4] 刘春娥，刘峰.水产品中氟喹诺酮类药物残留检测研究进展[J].安徽农业科学，2010，38(3)：1116-1118.
[5] 农业部.水产品中诺氟沙星、盐酸环丙沙星、恩诺沙星残留量的测定液相色谱
法[S].农业部783号公告，2006.
[6] 李佩佩，陈雪昌，张小军，等.高效液相色谱法检测水产品中氟喹诺酮类药物残
留量方法的优化[J].中国渔业质量与标准，2012，2(2)：84-88.
[7] 陈丽，杨长志，刘永，等.高效液相色谱法同时测定水产品中多种氟喹诺酮类药物的残留量[J].化学工程师，2009(9)：25-27.。