罗格列酮对糖尿病肾病大鼠肾小管上皮整合素连接激酶和α-平滑肌肌动蛋白表达的影响

罗格列酮对糖尿病肾病大鼠肾小管上皮整合素连接激酶和α-
平滑肌肌动蛋白表达的影响
刘爱林;张皎月
【摘要】目的探讨罗格列酮对糖尿病肾病大鼠肾小管上皮整合素连接激酶和o-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响.方法 30只健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组、阳性对照组和罗格列酮处理组,每组10只,正常对照组给予普通营养饲料喂养,阳性对照组和罗格列酮处理组给予高脂饲料喂养,连续喂养12周后,阳性对照组和罗格列酮处理组大鼠腹腔注射30 mg/kg链脲佐菌素,正常对照组给予等量枸橼酸缓冲液.成功制备DKD模型后,罗格列酮处理组大鼠给予罗格列酮3 mg/kg灌胃,正常对照组和阳性对照组给予等量生理盐水灌胃.连续给药28周后,对各组大鼠进行称重,检测FBG、HbA1c和24 h尿蛋白水平,实时荧光定量PCR检测右肾上极皮质组织中ILK和α-SMA表达.结果罗格列酮处理组和阳性对照组大鼠体重均低于正常处理组,而相对肾重均高于正常对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05),罗格列酮处理组大鼠体重均高于阳性对照组,而相对肾重低于阳性对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05);罗格列酮处理组大鼠FBG、HbA1c和24 h尿蛋白水平均高于正常对照组,但均低于阳性对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05);罗格列酮处理组大鼠右肾上极皮质组织中ILK mRNA和α-SMA mRNA相对表达量均高于正常对照组,但均低于阳性对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 DKD大鼠肾组织中ILK 和α-SMA呈高表达,罗格列酮可下调DKD大鼠肾组织中ILK和α-SMA表达,可能通过抑制肾小管上皮细胞转分化发生而延缓肾小管间质纤维化.
【期刊名称】《实用药物与临床》
【年(卷),期】2016(019)009
【总页数】4页(P1085-1088)
【关键词】糖尿病肾病;罗格列酮;上皮整合素连接激酶;α-平滑肌肌动蛋白
【作者】刘爱林;张皎月
【作者单位】孝感市中心医院内分泌科,湖北孝感432000;华中科技大学同济医学
院附属协和医院内分泌科,武汉432000
【正文语种】中文
糖尿病肾病(Diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病所致最严重且危害最大的
慢性并发症，患者可出现肾小球硬化、渐进性肾功能损害及蛋白尿，晚期发生肾功能衰竭，是造成患者死亡的重要原因[1]。

研究表明，肾小管上皮细胞转分化在DKD发生、进展中发挥关键性作用[2]。

肾小管上皮细胞转分化过程涉及诸多信号传导通路及细胞因子，整合素连接激酶(Integrin-linked kinase，ILK)作为具有多
种功能的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，参与整合素介导的信号传导，是肾小管上皮细
胞转分化过程中关键性效应物[3]。

α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)作为肌成纤维细胞的标志物，亦是肾小管上皮细胞转分化过程的标志蛋白[4]。

罗格列酮是临床上常用的抗糖尿病药物，但其对糖尿病肾病进展过程是否有
影响，鲜有报道。

本研究通过分析罗格列酮对糖尿病肾病大鼠肾小管上皮ILK和
α-SMA表达的影响，探讨罗格列酮在糖尿病肾病进展中的意义，以期为临床实践提供基础资料。

1.1 实验动物及分组30只健康雄性SD大鼠购自河南省实验动物中心，4～5
周龄，体重110～130 g，实验前血糖、尿糖及尿蛋白检测显示为阴性。

利用随机数字表随机分为正常对照组(n=10)、阳性对照组(n=10)和罗格列酮处理组(n=10)。

1.2 方法
1.2.1 喂养方法及DKD大鼠模型制备正常对照组大鼠给予普通营养饲料喂养，热卡为351 kcal/100 g。

阳性对照组和罗格列酮处理组大鼠则给予高脂饲料喂养，热卡为436 kcal/100 g，成分比例：脂类22.3%、糖类44.4%、蛋白质18.6%，其余为维生素及矿物质。

饲料购自山东华康饲料公司。

连续喂养12周后，阳性对照组和罗格列酮处理组大鼠腹腔一次性注射30 mg/kg链脲佐菌素[5](购自美国Sigma公司)，正常对照组则给予等量枸橼酸缓冲液。

3 d后对三组大鼠测量尾静
脉血糖，若阳性对照组和罗格列酮处理组大鼠连续3次随机尾静脉血糖≥16.7 mmol/L则造模成功[5]，造模过程中阳性对照组有1只大鼠出现死亡，其余大鼠
均造模成功。

1.2.2 给药方法DKD大鼠模型制备成功后，罗格列酮处理组大鼠给予罗格列酮(批准文号：国药准字H20030569，生产单位：成都恒瑞制药有限公司)3 mg/kg
灌胃，正常对照组和阳性对照组则给予等量生理盐水灌胃，每天1次，连续给药
28周。

1.2.3 标本采集及处理给药28周后，对各组大鼠进行称重，将大鼠进行单笼喂养，禁食不禁水，收集24 h尿液，利用双缩脲法对24 h尿蛋白定量；尾静脉取
血1 mL，用于空腹血糖(FBG)和糖化血红蛋白(HbA1c)测定；用40 mg/kg戊巴
比妥钠腹腔内注射麻醉后，快速取出左肾，去掉背膜，滤纸吸干血迹后，用电子天平称重，计算相对肾重=肾重重量(mg)/体重(g)；取右肾上极皮质，保存于-70 ℃液氮中以备检。

1.2.4 肾脏组织病理学观察用4%多聚甲醛对肾组织固定24 h后，利用乙醇进行梯度脱水，用二甲苯透明、浸蜡、包埋。

常规切片后，用HE染色观察肾小管上皮细胞变化。

1.2.5 实时荧光定量PCR检测右肾上极皮质组织中ILK和α-SMA表达取右肾
上极皮质研磨后，用细胞裂解液进行裂解，用Trizol总RNA提取试剂盒(购自美
国Invitrogen公司)、紫外分光光度计(购自美国GE公司)对RNA纯度进行检测，取A260/A280≥1.80标本完成后续实验。

利用逆转录试剂盒(购自天根生化科技)
进行逆转录获得模板cDNA，以cDNA为模板用PCR试剂盒(购自天根生化科技)
完成PCR。

ILK、α-SMA及内参引物均由上海生工生物公司合成。

ILK引物：上游5′-GTGCCGGGAGGGCAACGCGGTG-3′，下游5′-CGGGGCCTTGTGCGAGTGG-3′；α-SMA引物：上游5′-GATGTACCCTGGGATCGCTGAC-3′，下游5′-AAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′；β-actin引物：上游5′-CATTGCCGACAGGATGCAG-3′，下游5′-CTCGTCATACTCCTGCTTGCTG-3′。

PCR反应条件：94 ℃ 60 s，92 ℃ 45 s，
56 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，连续进行38个循环。

用2-△△Ct法获得右肾上极皮质中ILK mRNA和α-SMA mRNA相对表达量。

1.3 统计学处理利用SPSS 21.0统计分析软件进行统计学处理，计量资料采用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，
P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 三组大鼠体重和相对肾重罗格列酮处理组和阳性对照组大鼠体重均低于正
常处理组，而相对肾重均高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，罗格列
酮处理组大鼠体重高于阳性对照组，而相对肾重低于阳性对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2 三组大鼠FBG、HbA1c和24 h尿蛋白比较罗格列酮处理组大鼠FBG、HbA1c和24 h尿蛋白水平均高于正常对照组，但均低于阳性对照组，差异有统
计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3 肾小管病理形态学观察肾脏组织病理学检查显示，与正常对照组比较，阳
性对照组大鼠肾小管上皮细胞出现排列紊乱、脱落、坏死，空泡样、颗粒样变性，部分肾小管出现萎缩；罗格列酮处理组肾小管上皮细胞病变较阳性对照组减轻，见
图1。

2.4 三组大鼠右肾上极皮质组织中ILK和α-SMA表达罗格列酮处理组大鼠右
肾上极皮质组织中ILK mRNA和α-SMA mRNA相对表达量均高于正常对照组，但均低于阳性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

罗格列酮是2型糖尿病患者常用的噻唑烷二酮类降糖药物，可增强胰岛素敏感性，亦可特异性激活过氧化物增殖激活受体γ，在减少炎性因子形成和释放中发挥重要作用[6]。

有研究表明，罗格列酮可抑制TNF-α表达而减轻脓毒症急性肾损伤[7]。

亦有研究表明，罗格列酮在肾脏、肝脏等多个器官中具有抑制血管新生、抗纤维化作用[8]。

目前，罗格列酮在控制2型糖尿病患者血糖中的作用已得到临床认可，
本研究尝试对罗格列酮在DKD发病、进展中的功效及可能机制进行探讨。

糖尿病作为一种消耗性疾病，造模组大鼠出现“三多一少”症状。

研究结果显示，罗格列酮处理组和阳性对照组大鼠体重均低于正常处理组，而相对肾重、FBG、HbA1c和24 h尿蛋白水平较高。

肾脏组织病理学检查显示，阳性对照组大鼠肾
小管上皮细胞出现排列紊乱、脱落、坏死，空泡样、颗粒样变性，部分肾小管出现萎缩，提示利用注射链脲佐菌素的方法可成功构建DKD大鼠模型，模型大鼠出现DKD相关症状表现。

此外，罗格列酮处理组大鼠体重均高于阳性对照组，而相对
肾重、FBG、HbA1c和24 h尿蛋白水平较低，说明罗格列酮处理DKD模型大鼠可有效减轻糖尿病相关症状及肾脏组织损伤，进而减少蛋白尿，对延缓DKD进展发挥积极作用，肾小管病理形态学观察结果亦显示，罗格列酮处理组肾小管上皮细胞病变较阳性对照组减轻。

研究表明，DKD病情进展与肾小管上皮细胞损伤及肾小管间质纤维化密切相关[1]。

研究发现，肾小管上皮细胞可通过转分化转化为具有间质肌成纤维细胞的新表型，在加速间质纤维化过程中发挥关键性作用[4]。

α-SMA是肌成纤维细胞的蛋白标志物，而鉴于病理情况下肾脏组织中肌成纤维细胞大多来源于肾小管上皮细胞转分化，
因此，α-SMA亦可作为肾小管上皮细胞发生转分化的标志物[9]。

研究表明，转化生长因子在肾小管上皮细胞发生转分化过程中发挥重要的正向调控作用[10]。

而ILK作为重要的信号转导蛋白激酶，是转化生长因子信号通路下游重要因子，可能参与了肾小管上皮细胞转分化调控过程，本研究显示，罗格列酮处理组和阳性对照组大鼠右肾上极皮质组织中ILK mRNA和α-SMA mRNA相对表达量均高于正常对照组(P<0.05)，说明ILK和α-SMA在DKD模型大鼠肾组织中呈高表达，提示肾小管上皮细胞可能通过转分化而加速DKD大鼠肾脏纤维化过程，本研究显示，罗格列酮处理组大鼠右肾上极皮质组织中ILK mRNA和α-SMA mRNA相对表达量均低于阳性对照组(P<0.05)，说明罗格列酮可通过抑制肾小管上皮细胞发生转分化，而延缓DKD大鼠肾组织纤维化过程，从而保护DKD大鼠肾脏组织。

综上所述，DKD大鼠肾组织中ILK和α-SMA呈高表达，提示DKD大鼠肾小管上皮细胞发生转分化；罗格列酮可下调DKD大鼠肾组织中ILK和α-SMA表达，可能通过抑制肾小管上皮细胞转分化发生而延缓肾小管间质纤维化，达到保护肾功能的作用。

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