HIS镍柱纯化方法之欧阳历创编

纯化前准备
1.
2.推荐在中性至弱碱性条件下（pH 7-8）结合重组蛋白。

磷酸盐buffer是常用的缓冲液，Tric-Cl在一般情况下可用，但要注意它会降低结合强度。

3.避免在buffer中包含EDTA或柠檬酸盐等螯合剂。

4.若重组蛋白以包涵体形式表达，在所有的buffer中添加6
M盐酸胍或8 M尿素
5.避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：NH4，甘
氨酸，精氨酸，Tris，等等
6.各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，，比如DTT，防
止二价Ni被还原；
7.不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失；
8.缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作
用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%（v/v）
9.缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；
10.可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，最
高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染
注：
1.包含尿素的样品可直接进行SDS-PAGE分析，若样品中包
含盐酸胍，在SDS-PAGE前则需先用含有尿素的buffer进行透析
2.除利用咪唑洗脱蛋白，其它方法，如低pH值法等可被应
用，详见说明书
Binding buffer 中咪唑的浓度
在洗涤时所用的Binding buffer 中咪唑浓度越大，重组蛋白纯度越高。

但过高的咪唑浓度将导致蛋白的洗脱。

合适的咪唑浓度需要优化。

Buffer 的准备
所用的水及化学物质须是高纯度的。

Buffer 在使用前需经0.45μm滤膜过滤。

所用高纯度的咪唑需在280nm 处无吸光度或吸光度极低。

推荐 buffer （使用前用0.45 μm filter过滤）
Binding buffer：20 mM 磷酸盐
0.5 M NaCl
20- 40 mM 咪唑 pH 7.4 （咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！）
Elution buffer ：20 mM 磷酸盐
0.5 M NaCl
500 mM 咪唑 pH 7.4 （咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！）
1. 样品准备
样品需被充分溶解。

过柱前经0.45 μm滤膜过滤。

样品以pH 7.4 binding buffer 溶解。

勿用强酸强碱调节pH 值，否则将可能导致沉淀。

2. 重力纯化法 Ni-NTA Column 准备
1.温和地颠倒瓶中的Ni-NTA Agarose 数次。

2. 吸取2ml的树脂加入15ml离心管中，使树脂在重力(5–10 minutes)或低速离心(5 minute at 500 × g)，轻柔的吸出上清。

3. 加入5ml的无菌蒸馏水，温和的颠倒柱子3min，离心 5
minute at 500 × g，轻柔的吸出上清。

4. 用bingding buffer 重复第3步。

5. 在Ni 柱中加入等体积的bingding buffer，制成50%的
slurry
Ni柱子的beads浸泡在20% ethanol中，倾除20% ethanol溶液，用蒸馏水将beats调成75%（v/v）的浓浆状的凝胶。

.沿玻璃棒一次倒入柱子中，静置。

3. 样品与Ni 柱结合
1.每1ml 50%的slurry中加入4ml 的样品。

1ml 50%的
slurry 可结合20mg His-蛋白
2.将混合物室温，低速振荡孵育1h
4. Buffer 洗涤及洗脱
1.离心 5 minute at 500 × g，轻柔的吸出上清。

上清
保存放在4℃for SDS-PAGE analysis。

2.用1 ml Binding Buffer洗涤柱子，在摇床上温和的振
荡2min，然后低速离心 5 minute at 500 × g，小心
吸出上清，重复该步一次。

上清保存放在4°C for
SDS-PAGE analysis。

3.用0.5 ml Elutionbuffer洗脱柱子，方法同4。

重复该
步三次。

分管收集4次洗脱液，存放在4°C for SDS-
PAGE analysis。

纯化柱的再生：
如果纯化同一种蛋白，Ni-NTA resin不需要再生，可
以重复使用5－7次。

1.用5倍柱体积的含50 mM EDTA，20 mM 磷酸盐，0.5 M NaCl pH 7.4的buffer
洗涤柱子，洗去螯合的镍离子。

2.用5倍柱体积的binding buffer洗涤柱子
3.用5倍柱体积的无菌去离子水洗涤柱子
4.用0.5倍柱体积的含0.1 M 的NiSO4的无菌水溶液装填
5.用5倍柱体积的无菌去离子水洗涤柱子
6.用5倍柱体积的bingding buffer洗涤柱子
7.加入20％的乙醇4-30℃长期保存。

lysis buffer中加咪唑的目的是与杂蛋白竞争，使那些与填料亲和力弱的杂蛋白不能挂柱；wash buffer中加咪唑是为了洗去大部分已挂柱的杂蛋白（也会洗去少量目的蛋白）；elution buffer中加梯度咪唑，而且咪唑浓度渐高，是咪唑和目的蛋白竞争性结合填料，从而把目的蛋白从柱上洗脱。

层析柱再生
1. 除镍
①10倍柱床体积的stripping buffer洗柱，1ml/min②10倍柱床体积的binding buffer洗柱，1ml/min (可省)
③10倍柱床体积的ddH2O洗柱，1ml/min
2. 除去柱上残余蛋白
①1M NaOH充满柱并保持2h②10倍柱床体积的binding buffer洗柱，1ml/min (可省)
③10倍柱床体积的ddH2O洗柱，1ml/min
3. 挂镍
①0.5倍柱床体积的0.1NiSO4洗柱，1ml/min②5倍柱床体积的ddH2O洗柱，1ml/min
③5倍柱床体积的binding buffer洗柱，1ml/min
4.20%乙醇过柱，4℃保存
注：stripping buffer：2 mM Na3PO4
0.5 M NaCl
50 mM Na2EDTA pH 7.4
蛋白纯化
Elution buffer 洗柱
①10倍柱床体积的binding buffer平衡②样品过滤，上样（关阀门，15min）
③10倍柱床体积的binding buffer洗柱④Elution buffer 洗脱蛋白（一般蛋白位于前5ml）
⑤超滤管10000rpm，浓缩离心10min
注： 500ml Binding buffer：20 mM Na3PO4 20×10-3×0.5×380.16=3.8g
0.5 M NaCl 0.5×0.5×58.5=14.625g
5mM 咪唑 5×10-3×0.5×68.09=0.17g
pH 7.4 （咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！）
500ml
Elution buffer ：20 mM Na3PO4 20×10-3×0.5×380.16=3.8g
0.5 M NaCl 0.5×
0.5×58.5=14.625g
500 mM 咪唑 0.5×0.5×68.09=17g
pH 7.4 （咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！）。