实验十一底物浓度对酶促反应速度的影响

实验十一底物浓度对酶促反应速度的影响
一、目的
验证底物浓度对酶促反应速度的影响，并学习双倒数作图法求K m。

二、原理
⎯
⎯→
+O
H
磷酸苯二钠碱性磷酸酶+
磷酸氢二钠
苯酚
⎯
⎯
2
三、主要仪器与试剂
(1)恒温水浴箱、试管、移液管、分光光度计；
(2)0.1mg/ml标准酚液、碱性溶液（0.5M NaOH）、0.3% 4-氨基安替比林、0.5%铁氰化钾、0.1M
pH10碳酸缓冲液、0.04M磷酸苯二钠、碱性磷酸酶、
四、操作
1、取试管7只，依下表加入各种试剂（ml）：
0 ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ
0.04M磷酸苯二钠0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.8
pH10碳酸缓冲液0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 H2O 1.2 1.15 1.1 1.0 0.9 0.8 0.4 37℃水浴保温5min，然后各加入0.1ml碱性磷酸酶液
底物终浓度mM 0 1 2 4 6 8 16 自测值OD 0.150 0.491 0.783 0.812 0.934 1.074 计时，37℃水浴保温15min。

[注] 终浓度计算：如Ⅱ号管，40mM磷酸苯二钠加入0.1ml，试管中溶液总量2ml，则
[S]磷酸苯二钠=40×0.1/2=2mM
2、保温结束，立即加入碱性溶液1ml，终止反应。

3、各管中分别加入0.3%的4-氨基安替比林1ml，0.5%铁氰化钾2ml，充分混匀，静置10min。

以0号调“0点”，于510nm比色，测得OD值。

由测得的OD值，在实验十画出的酚标准曲线上查找酚的含量（μg），以酚量代表该试管中酶
促反应速度（V），也代表该试管中酶总活力单位（U），即在37℃水浴保温15min产生1μg的酚量
为1个酶活单位（U）。

[预实验测值]：酚饱和曲线
ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ
OD值0.665 0.88 1.22 1.23 1.3
[S] 1 2 4 6 8 酚量（μg）[酶活、V] 12.5 22 33.5 33.7 37
4、以每管中酶促反应速度（V，即酶活单位、酚含量）做纵坐标，以底物浓度[S]为横坐标在坐
标纸上作图，此为酚饱和曲线。

5、以酶活单位的倒数（即1/V、1/酚含量）做纵坐标，以底物浓度的倒数1/[S]为横坐标在坐标
纸上作图，求碱性磷酸酶的K m值。

[预实验测值]：双倒数法求Km
ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ
[S] 1 2 4 6 8 16
1/[S] 1 1/2 1/4 1/6 1/8
V（μg）[酶活] 12.5 22 33.5 33.7 37
0.027
0.0296
0.045
1/V 0.08
0.0298
酚饱和曲线 双倒数图形 五、安排与要求
2人做1份；
绘制2表、2图：酚饱和曲线测定的图表、双倒数法求取Km 值的图表。

（上面的图表）
下次实验请学生自带镊子、剪刀。

作业：
比色方法测定溶液浓度的基本原理是什么？已知物质标准液浓度测定溶液未知浓度有几种方法？
酶促反应与分光光度法介绍：
（一）酶促反应
在温度、pH 及酶浓度恒定条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大影响。

在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度(V )随底物浓度(S )的增加而增加，但当底物浓度继续增加时，反应速度的增加就比较小，当底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值最大速度(Vmax)。

米氏方程(Michaelis —Menten) ]
[][max S K S V V m +⋅= 米氏常数是反应速度(V )等于最大反应速度一半时的底物浓度，它是酶的特征性常数。

大多数酶的K m 值在10-1~10-6mol/L 之间。

将Michaelis —Menten 变形成Lineweaver —Burk 方程式：
max
max 1][11V S V K V m +⋅= [酶促反应速度]单位时间内，单位体积中底物的减少量或产物的增加量，浓度/单位时间。

酶促反应速度仅在最初阶段保持恒定，随着时间延长酶促反应速度下降：底物浓度↓、酶失活、产物浓度↑、产物对酶抑制。

底物浓度与酶促反应速度的关系：一级反应（二者正比）→混合级反应（非正比性增加）→零级反应（V 达到极限值，此时酶已被底物饱和）。

[酶活力]指酶催化一定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下它所催化的某一反应的反应速度来表示。

测定酶活力就是测定酶促反应速度。

（二）分光光度法
分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一门技术。

物质对光的吸收具有选择性，各种不同的物质都具有各自的吸收光谱。

当某单色光通过溶液时，其透射光强会减弱。

因为有一部分光在溶液的表面被反射或散射，一部分光被组成此溶液的物质所吸收，只有一部分光可透过溶液。

入射光 = 反射光 + 散射光 + 吸收光 + 透射光 如果用蒸馏水（或组成此溶液的溶剂）作为“空白”去校正反射、散射等因素造成的入射光的损失，则： 入射光 = 吸收光 + 透射光
[Lambert-Beer 定律]：
当一束单色光通过溶液时，光波被吸收一部分，吸收多少与溶液中溶质的浓度及溶液厚度成正比，这就是Lambert-Beer 定律。

当入射光、摩尔吸光系数和溶液的光径长度不变时，透过光是根据溶液的浓度而变化的。

这是分光光度计设计的基本原理。

L C K I
I ⋅⋅=0lg ；或 cl I I ε−⋅=100 I 0表示入射光强度；
I 表示透过光强度；
L 表示溶液的厚度，也称溶液的光径长度cm ；
K 、ε为消光系数（吸光系数），表示物质对光的吸收特性，消光系数值越大，该物质吸收光的能力越强，测定的灵敏度越高，消光系数是物质对光吸收的特征值。

消光系数的表示方法有百分浓度消光系数和摩尔浓度消光系数。

百分浓度消光系数（）即以百分浓度来表示的消光系数，它等于溶液浓度为1%、液层厚度为1cm 时的光密度值。

摩尔浓度消光系数（）即以摩尔浓度来表示的消光系数，它等于溶液浓度为1mol/L 、液层厚度为1cm 时的光密度值。

%
11cm K M cm K 1C 为溶液中溶质的浓度；
透光度（transmittance ）T = I ／I 0，表示光线透过溶液的程度。

吸光度（absorbance ）A = lg(1/T ) = lg(I 0/I ) = KCL ，表示溶液对光的吸收程度，习惯上也用光密度（optical density ，OD ）表示。

当I ＝I 0时，lg(I 0/I ) = 0，表示溶液完全不吸收光线；
当I ＜＜I 0时，lg(I 0/I )值大，表示溶液吸收光线较多；
当I →0时，lg(I 0/I ) 值无穷大，表示光线几乎被溶液完全吸收，溶液不透光。

采用适当的光源、单色器（棱镜、滤光片等）和适当的光源接受器，可使溶质浓度的测定范围扩展到可见光区、紫外光区和红外光区，并提高灵敏度。

分光光度计可在较宽的光谱范围（200~1000nm ）内获得较纯的单色光，因此，既可用于可见光，也可用于紫外光或红外光的吸光测定。

分光光度法可利用物质特有的吸收光谱曲线进行定性定量测定。

光谱位置： 颜色 紫外 紫 蓝 青 绿 黄 橙 红 红外波长nm ＜400 400~440 440~480 480~490490~550550~590590~630 630~780 ＞
780
互补色：将2种颜色的光按适当强度比例混合时可以形成白光，则这2种色光为互补色。

白
绿 青 青蓝 蓝 紫
黄
橙
红
溶液显色原理：溶液对光具有选择性吸收现象，对某波长可见光吸收，溶液呈现被吸收波长光的互
补色光的颜色，如吸收绿色波长的光，则容易显现紫色。

无色透明：溶液对各波长的可见光均不吸收，全部通过。

黑色：溶液对各波长的可见光全部吸收。

灰色：溶液对各波长的可见光无明显选择性，较均匀地部分吸收。

分光光度计种类
72型——可见光；
75型——紫外、可见光
分光光度计使用
在分光光度计的读数盘上附有两种数字：一种是等距离标尺，为透光度，用T 表示，单位％，从左到右逐渐增加（0~100）；另一种是不等距离的标尺，为吸光度，用A 表示，从左到右逐渐减少（∝→0）。

使用时，开启电源，打开试样室盖（光门自动关闭），预热20min ，用波长调节器调到所需的波长。

根据不同波长、光量选用适当的灵敏度档（1、2或3）。

¾调节“0”按钮，使T数字显示在“0.00”。

¾将对照液与待测定液分别装入比色杯内，放入比色盒中，盖好盖，调节透光率T“100%”按钮，使数字显示“100.0”。

¾轻轻拉动比色槽滑杆，使其他比色杯依次处于光路上，同时从显示器上读出吸光度值（OD）。

测定完成关闭开关，取出比色杯，蒸馏水洗涤2~3次。

用已知标准液浓度求取溶液未知浓度的方法：
（1）标准管法求出待测溶液的浓度
A = KCL→A1=K1C1L1
A2=K2C2L2 1——已知；2——未知
L1= L2；K1=K2
故：C2=（A2/A1）×C1
（2）标准曲线法
当分析大批待测溶液时，采用标难曲线法则比较方便。

先配制一系列已知不同浓度的标准物溶液，按与待测物同样方法处理显色，分别读取各管吸光度值，以各管吸光度为纵坐标，各管溶液浓度为横坐标，在方格坐标纸上作图得标准曲线，以待测物吸光度从标准曲线上可求得待测物的浓度。

在制作标准曲线时，至少需配制5种浓度递增的标准溶液，测出的数据至少要有3个点落在直线上，这样的标准曲线方可用来求待测溶液的浓度。

标准曲线范围在待测物浓度的一半到两倍之间，并使吸光度值在0.05~1.00范围内为宜。

标准曲线（浓度-吸光度曲线）。