芬苯达唑对慢性髓系白血病K562细胞的增殖抑制作用

芬苯达唑对慢性髓系白血病K562细胞的增殖抑制作用
贺立彩;史柳芝;巩瑞;杜转运;顾海华;吕建新
【摘要】目的:探讨抗寄生虫药芬苯达唑对慢性髓系白血病细胞K562的作用及机制.方法:采用CCK-8法检测芬苯达唑对K562和正常人外周血单个核细胞(PBMC)生长的影响;台盼蓝拒染实验检测芬苯达唑对K562细胞活力的影响;瑞氏染色观察芬苯达唑对K562细胞形态的影响;流式细胞术检测芬苯达唑对K562细胞周期分布的影响;Western blot检测芬苯达唑对K562细胞周期相关蛋白表达的影响;免疫荧光观察芬苯达唑对K562细胞核的改变.结果:芬苯达唑能够显著抑制K562细胞的生长,而对PBMC生长无明显影响;进一步的研究发现,芬苯达唑显著抑制K562
细胞增殖并诱导细胞发生G2/M期阻滞;芬苯达唑处理K562细胞后,细胞分裂周期蛋白25C(Cdc25C)磷酸化、周期素依赖性激酶1(Cdk1)-Tyr15去磷酸化以及cyclin B1磷酸化增加;免疫荧光结果证实芬苯达唑诱导K562多核细胞增多
(P<0.01),发生有丝分裂灾难.结论:芬苯达唑通过调控周期相关蛋白诱导K562细胞发生G2/M期阻滞.%AIM:To investigate the effect of fenbendazole (FBZ) on the proliferation of human chronic myelogenous leukemia (CML) cell line K562.METHODS:The CCK-8 assay was used to detect the effect of FBZ on viability of the K562 cells and normal peripheral blood mononuclear cells (PBMC).The cell growth was measured by the method of Trypan blue exclusion.The cell cycle was analyzed by flow cytometry.The cell cycle-related proteins were detected by Western blot.RESULTS:The growth of
K562 was significantly inhibited by FBZ.However, it elicited little cytotoxic effect on PBMC.Furthermore, FBZ induced G2/M phase arrest and mitotic catastrophe in the K562 cells based on the changes of nuclear morphology,
DNA content, mitotic marker analysis and the number of polykaryocytes.CONCLUSION:Fenbendazole significantly inhibits the proliferation of K562 cells and induces cell cycle arrest at G2/M phase by the regulation of cell cycle-related proteins.
【期刊名称】《中国病理生理杂志》
【年(卷),期】2017(033)006
【总页数】5页(P1012-1016)
【关键词】芬苯达唑;慢性髓系白血病;增殖抑制;G2/M期阻滞
【作者】贺立彩;史柳芝;巩瑞;杜转运;顾海华;吕建新
【作者单位】温州医科大学检生学院,浙江温州 325035;温州医科大学检生学院,浙江温州 325035;温州医科大学检生学院,浙江温州 325035;温州医科大学检生学院,浙江温州 325035;温州医科大学检生学院,浙江温州 325035;温州医科大学检生学院,浙江温州 325035
【正文语种】中文
【中图分类】R733.72
慢性髓系白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是血液系统干细胞起源、造血祖细胞驱动的骨髓恶性增殖性疾病[1]，90%以上患者存在特征性的费城染色体，即t(9;22) (q34;q11)染色体易位，形成BCR/ABL融合基因[2]。

该融合基因
编码P210蛋白，使其酪氨酸激酶活性增强并激活下游信号转导通路，抑制细胞凋亡，在促进CML的发病中发挥着重要作用[3]。

伊马替尼是CML的一线治疗药物，它是靶向BCR/ABL酪氨酸激酶的抑制剂。

虽然多数费城染色体阳性CML患者伊
马替尼治疗后可以取得显著疗效，但耐药成为伊马替尼治疗CML失败的主要原因[4-5]。

据统计高达25%的患者对伊马替尼原发性耐药[6]。

因此，急需寻找新的具有抗CML作用的低毒副作用药物。

老药新用是一种抗白血病药物筛选的高性价比策略。

这是因为临床批准用药的药代动力学已知，这些药物已在人体或动物体内进行过毒理学测试，安全性较高。

若研究证实某些药物具有抗白血病作用，将很快可以进入二期临床试验进行验证，能够极大缩短研发周期和成本。

在过去的十几年中，FDA批准了一些老药用于治疗恶性肿瘤[7-9]。

本课题组前期实验通过对1 000多种FDA 批准药物进行系统地筛选，发现芬苯达唑(fenbendazole，FBZ)具有明显的抗CML作用。

芬苯达唑属于苯并咪唑家族药物的一种，可用于防治肠道寄生虫病，是广谱类杀寄生虫药物[10]。

毒理学实验表明，动物对芬苯达唑具有非常好的耐受性[11]。

这就提示芬苯达唑具有较好的临床应用前景。

本研究对芬苯达唑抗CML白血病的作用和机制进行了初步研究，以期为CML的治疗提供重要的科学理论依据。

1 细胞
慢性髓系白血病细胞株K562购自ATCC细胞库；正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)采自学生志愿者。

2 主要试剂
胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自HyClone；培养基RPMI-1640购自Gibco；CCK-8细胞试剂盒购自Dojindo；瑞氏染色液购自南京建成有限公司；青霉素、链霉素双抗及细胞周期检测试剂盒均购自碧云天生物技术公司；抗周期素依赖性激酶1(cyclin-dependent kinase 1，Cdk1)、p-Cdk1 (Tyr-15)、细胞分裂周期蛋白25C(cell division cycle protein 25C，Cdc25C)、p-cyclin B1 (Ser126)抗体、HRP标记的鼠 II 抗、兔 II 抗和免疫荧光试剂盒均购自CST；β-
tubulin鼠源单克隆抗体购自Sigma；BSA、SDS、Tris、甘氨酸和聚丙烯酰胺购
自上海生工。

3 主要方法
3.1 细胞培养 K562细胞采用含1×105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素和10% FBS的RPMI-1640培养液，PBMC补加IL-2 (1×105 U/L)，置于37 ℃、5% CO2、95% O2的培养箱中常规培养。

3.2 细胞活力检测取对数生长期细胞接种于96孔板，每孔1×104个细胞，设3
个复孔，不同剂量FBZ (0、0.1、0.2、0.4和0.8 μmol/L)分别处理K562细胞和PBMC细胞48 h。

每孔加入10 μL的CCK-8溶液(5 g/L)，37 ℃继续孵育2 h，
终止培养，450 nm处测吸光度(A)值。

3.3 Western blot实验收集各组细胞，细胞裂解液提取总蛋白，行SDS-PAGE，电泳结束后将凝胶转移到PVDF膜上。

用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭PVDF膜1 h。

分别加入相应的 I 抗，4 ℃摇床孵育过夜。

第2天，将膜用TBST
洗3次，每次10 min。

加入HRP标记的相应 II 抗(1∶2 000)，室温孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。

将PVDF膜置于ECL试剂中反应1～3 min，经超
灵敏化学发光成像分析仪(Bio-Rad凝胶成像系统)扫描得到目的条带。

3.4 免疫荧光细胞离心涂片机离心制片，4% PFA室温固定，4% Triton X-100室温渗透后用含10% NDS的PBS室温封闭1 h。

I 抗1∶500稀释，4 ℃加湿盒过夜；II 抗1∶500稀释，37 ℃避光孵育1 h；PBS漂洗，荧光抗淬灭剂封片。

荧光显微镜观察并拍照。

3.5 瑞氏染色细胞离心涂片机离心制片，滴加配制好的瑞氏染色液(Ⅰ液和Ⅱ液
1∶1混匀后静置0.5 h)室温染色5 min，在显微镜下观察并拍照。

3.6 流式细胞术离心收集各处理组细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)洗涤2次，加入70%乙醇溶液在-20 ℃固定过夜。

第2天，
1 000×g离心5 min弃去乙醇并用预冷的PBS相同条件洗2遍。

每管细胞应用碘化丙啶染色后，流式细胞仪检测细胞的DNA含量，用FlowJo软件分析细胞周期。

实验重复3次。

4 统计学处理
用SPSS 19.0软件进行统计学分析。

数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，
多组计量资料间的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用SNK-q 检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

1 芬苯达唑对K562和PBMC细胞生长的的影响
芬苯达唑系苯并咪唑类驱虫药，其化学结构如图1A所示。

为了研究芬苯达唑对
K562细胞和PBMC细胞生长的影响，我们用不同浓度的芬苯达唑(0、0.1、0.2、0.4和0.8 μmol/L)分别处理K562和PBMC细胞48 h，利用CCK-8法检测细胞
生长情况。

结果显示，芬苯达唑对K562细胞有显著的生长抑制作用，且呈明显的剂量依赖性。

芬苯达唑对K562细胞作用48 h的IC50为0.17 μmol/L (0.12～
0.24 μmol/L)，但芬苯达唑在高达0.8 μmol/L时对PBMC生长仍无明显影响，
见图1B。

2 芬苯达唑对K562细胞增殖能力和细胞活力的影响
不同浓度的芬苯达唑(0、0.1、0.2、0.4和0.8 μmol/L)分别处理K562细胞0、24、48和72 h后进行台盼蓝染色。

结果显示，与对照相比，0.2、0.4和0.8
μmol/L的芬苯达唑处理K562细胞24 h，细胞数目明显减少(图2A)，而细胞活
力无明显改变(图2B)，说明芬苯达唑早期抑制了K562细胞的增殖能力。

3 芬苯达唑对K562细胞形态的改变
0.4 μmol/L的芬苯达唑细胞处理K562细胞0、24和48 h后进行瑞氏染色，检
测细胞形态的改变。

结果显示，细胞出现明显的染色质凝集及核膜崩解的现象，提示细胞发生有丝分裂期阻滞，见图3。

4 芬苯达唑对K562细胞周期的影响和细胞周期相关蛋白表达的改变
为了验证芬苯达唑是否影响了K562细胞的周期分布，我们用对照溶剂DMSO和0.4 μmol/L FBZ分别处理K562细胞24 h，采用流式细胞术对细胞的周期分布进行了检测和分析。

结果显示芬苯达唑处理K562细胞24 h后G0/G1 期所占比例
明显减少，同时伴随着G2/M 期比例显著升高(图4A)，说明芬苯达唑能够诱导
K562细胞发生G2/M 期阻滞。

这一结果与芬苯达唑早期能够显著抑制K562细胞的生长而对细胞活力无明显改变相一致。

为了探索芬苯达唑是如何将K562细胞抑制在G2/M期的，0.4 μmol/L 芬苯达唑处理K562细胞不同时间检测细胞周期相关蛋白的改变。

结果显示，随着药物作用时间的延长，cyclin B1的活化形式，即Ser126位磷酸化的cyclin B1显著增加；总的Cdk1蛋白无明显改变，Cdc25C磷酸化显著增加，同时Cdk1-Tyr15磷酸化(Cdk1非活化形式)显著减少，见图4B。

5 芬苯达唑使K562细胞发生分裂期灾难
对照溶剂DMSO和FBZ分别处理K562细胞24 h和48 h后，利用DAPI和β-tubulin进行免疫荧光染色。

与对照组相比，FBZ处理K562细胞后多核细胞的比例明显增加，见图5。

慢性髓性白血病占成人白血病的15%，全球年发病率为(1.6～2.0)/10万[12]。

伊
马替尼自2001年广泛用于临床治疗慢性髓系白血病以来，有效地延长了病人的生存期，但病人出现严重的副反应如水肿、骨骼肌肉痛、骨骼肌肉抽筋疲劳等[13]，且有高达25%的患者对伊马替尼原发性耐药[6]。

因此寻找一种低毒的有效药物尤为重要。

课题组前期实验通过对1 000多种FDA 批准药物进行系统地筛选，发现芬苯达唑具有明显的抗CML作用。

芬苯达唑是一种广谱、高效、低毒的驱虫药，属于苯并咪唑药物，可用于防治肠道寄生虫病和治疗系统性蠕虫感染[14]。

毒理学实验表明，
动物对芬苯达唑具有非常好的耐受性。

小鼠口服给药LD50大于10 000 mg/kg [10](相当于常规治疗剂量的1 000倍)，腹腔给药LD50大于1 250 mg/kg，皮下注射给药LD50大于2 000 mg/kg。

在啮齿类动物研究中没有明显的不良反应报
道[15]，一项为期90 d的小鼠亚慢性毒性实验研究表明，芬苯达唑1 600 mg/kg 口服给药60 d后，继续2 500 mg/kg口服给药30 d未出现明显的毒副反应[11]。

本文检测到芬苯达唑在较低药物浓度0.4 μmol/L时就能有效抑制慢性髓系白血病
K562细胞的增殖，而对正常外周血单个核细胞无明显影响。

这表明芬苯达唑用来治疗白血病将是安全和有效的。

作为抗寄生虫药，芬苯达唑能够结合寄生虫的微管蛋白，抑制微管形成，影响肠道线虫摄取葡萄糖，从而影响其生存与繁殖，进而引起虫体死亡。

微管蛋白是细胞内微管的基本构成单位，在细胞骨架组成、运动和分裂过程中都发挥着非常重要的作用[16]。

我们通过形态学观察、细胞周期分析、周期相关蛋白的检测和多个核细胞的计数证实芬苯达唑诱导K562细胞发生M期阻滞并发生分裂期灾难。

有丝分裂期的关键调控因子是促分裂因子(mitosis-promoting factor, MPF)，该
因子由调节亚基cyclin B1和激酶Cdk1组成，在有丝分裂G2/M期转变中起关键作用[17-18]。

而Cdc25C的活性是细胞周期进入M期的关键步骤之一，Cdc25C 通过使Cdk1-Tyr15发生去磷酸化而激活cyclin B1/Cdk1促进细胞从G2期进入
M期[19-20]。

芬苯达唑在抗寄生虫治疗中耐受性好，安全性高。

而我们的研究证实，芬苯达唑在治疗浓度就能够显著抑制慢性髓系白血病K562细胞的增殖能力，发现了芬苯达唑的新用途和新适应症，为白血病治疗提供了一定的科学理论依据。

【相关文献】
[1] Neviani P, Harb JG, Oaks JJ, et al. PP2A-activating drugs selectively eradicate TKI-resistant chronic myeloid leukemic stem cells [J]. J Clin Invest, 2013, 123(10): 4144-4157.
[2] Taverna S, Giallombardo M, Pucci M, et al. Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21 [J]. Oncotarget, 2015, 6(26): 21918-21933.
[3] Deininger MW, Goldman JM, Melo JV. The molecular biology of CML [J]. Blood, 2000, 96(10):3343-3356.
[4] Giles FJ, Cortes JE, Kantarjian HM, et al. Accelerated and blastic phases of chronic myelogenous leukemia [J]. Hematol Oncol Clin North Am, 2004, 18(3):753-774.
[5] 梅芬, 李瑞玮, 杨同华.15-LO在慢性髓系白血病作用的研究进展[J].中国病理生理杂志, 2016, 32(10): 1916-1920.
[6] de Lavallade H, Apperley JF, Khorashad JS, et al. Imatinib for newly diagnosed patients with chronic myeloid leukemia: incidence of sustained responses in an intention-to-treat analysis [J]. Clin Oncol, 2008, 26(20): 3358-3363.
[7] Febbraro T, Lengyel E, Romero IL. Old drug, new trick: repurposing metformin for gynecologic cancers [J]. Gynecol Oncol, 2014, 135(3): 614-621.
[8] Kang D， Song Y, Chen W, et al. "Old Dogs with New Tricks": exploiting alternative mechanisms of action and new drug design strategies for clinically validated HIV targets [J]. Mol Biosys, 2014, 10(8):1998-2022.
[9] Wright GD. Something old, something new: revisiting na-tural products in antibiotic drug discovery [J]. Can J Microbiol, 2014, 60(3): 147-154.
[10]Wagil M, Bialk-Bielinska A, Puckowski A. Toxicity of anthelmintic drugs (fenbendazole and flubendazole) to aquatic organisms [J]. Environ Sci Pollut Res Int, 2015, 22(4): 2566-2573.
[11]Villar D, Cray C, Zaias J， et al. Biologic effects of fenbendazole in rats and mice: a review [J]. Am Assoc Lab Anim Sci, 2007, 46(6): 8-15.
[12]von Bubnoff N, Duyster J. Chronic myelogenous leuke-mia: treatment and mornitoring [J]. Dtsch Artzebl Int, 2010, 107(7): 114-121.
[13]Efficace F, Baccarani M, Breccia M, et al. GIMEMA health-related quality of life in chronic myeloid leukemia patients receiving long-term therapy with imatinib compared with the general population [J]. Blood, 2011, 118(17): 4554-4560.
[14]Sathi G, Bhargava IP, Shanker K. Benzimidazoles as anthelmintics [J]. Pharmazie, 1981, 36(2): 165.
[15]Toth LA, Oberbeck C, Straign CM， et al. Toxicity evaluation of prophylactic treatments for mites and pinworms in mice [J]. Contemp Top Lab Anim Sci, 2000, 39(2): 18-21.
[16]Barrowman MM, Marriner SE, Bogan JA. The binding and subsequent inhibition of
tubulin polymerization in Ascaris suum (in vitro) by benzimidazole anthelmintics [J]. Biochem Pharmacol, 1984, 33(19): 3037-3040.
[17]Ohi R, Gould KL. Regulating the onset of mitosis [J]. Curr Opin Cell Biol, 1999, 11(2): 267-273.
[18]Norbury C, Nurse P. Animal cell cycles and their control [J]. Annu Rev Biochem, 1992, 61(1): 441-470.
[19]Perdiguero E, Nebreda AR. Regulaion of Cdc25C activity during the meiotic G2/M transition [J]. Cell Cycle, 2004, 3(6): 733-737.
[20]Shibuya EK. G2 cell cycle arrest： a direct link between PKA and Cdc25C [J]. Cell Cycle, 2003, 2(1): 39-41.。