一种哈茨木霉固态发酵基质及其培养方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911165186.5
(22)申请日 2019.11.25
(71)申请人 中国林业科学研究院林产化学工业
研究所
地址 210042 江苏省南京市玄武区锁金五
村16号
(72)发明人 张宁　蒋剑春　杨静　赵剑　徐浩　
解静聪　
(74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限
公司 32200
代理人 唐循文
(51)Int.Cl.
C12N 1/14(2006.01)
C12R 1/885(2006.01)
(54)发明名称
一种哈茨木霉固态发酵基质及其培养方法
(57)摘要
一种哈茨木霉固态发酵基质及其培养方法，
所述的固态发酵基质是将毛竹粉末经盘磨处理
后作为基质的主要原料，再接种哈茨木霉菌，即
可实现哈茨木霉菌快速大量繁殖生长。

相对于传
统的哈茨木霉固态发酵基质组成，该配方不使用
玉米粉等粮食作物，并且大幅度减少了麸皮的用
量，为哈茨木霉的培养提供了新的可行的原料选
择。

权利要求书1页 说明书3页 附图1页CN 110885761 A 2020.03.17
C N 110885761
A
1.一种哈茨木霉固态发酵基质，其特征在于按重量份的组成为：8~9份盘磨毛竹粉，2~1份麸皮和25份哈茨木霉液态发酵培养基。

2.根据权利要求1所述哈茨木霉固态发酵基质，其特征在于所述盘磨毛竹粉由毛竹粉末过0.425mm筛，经FSP -300型高浓实验盘磨机盘磨4~5次，所得物料游离度达到170~180mL，烘干备用。

3.根据权利要求1所述哈茨木霉固态发酵基质，其特征在于所述哈茨木霉液态发酵培养基每升的组成按比例为：葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，硫酸铵0.75g，麸皮水80g，其中麸皮水由100g 麸皮，900g 水，煮沸20分钟后过滤而得。

4.权利要求1-3任一所述固态发酵基质培养哈茨木霉的方法，其特征在于步骤为：将哈茨木霉固态发酵基质搅拌均匀后湿热灭菌，冷却至室温，接入5wt.%哈茨木霉培养液，置于28℃培养箱中培养一周。

5.根据权利要求4所述固态发酵基质培养哈茨木霉的方法，其特征在于培养箱的摇床转数150r/min，培养时间120小时。

权　利　要　求　书1/1页CN 110885761 A
一种哈茨木霉固态发酵基质及其培养方法
[0001]
技术领域
[0002]本发明属于微生物领域，具体涉及一种哈茨木霉固态发酵基质及其培养方法。

[0003]
背景技术
[0004]微生物农药是生物农药的一种，是指微生物及微生物的代谢产物和由它加工而成的，具有杀虫、杀菌、除草、杀鼠或调节植物生长等活性的物质。

其中木霉是木质纤维素的主要降解微生物之一，通过产生抗生素、营养竞争、微寄生、细胞壁分解酵素、以及诱导植物产生抗性等机制，对于多种植物病原具有拮抗作用，具有保护和治疗双重功效。

木霉可以防治棉花、杜仲、人参、三七等幼苗立枯病，以及茉莉、花生和辣椒的白绢病、番茄的猝倒病等；据不完全统计，木霉至少对18个属的29种病原真菌在体外或体内表现有拮抗作用。

[0005]目前用于生物防治研究的木霉有8种，即哈茨木霉（Trichoderma harzinum）、钩状木霉（Trichoderma hamatum）、长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）、康氏木霉（Trichoderma koningii）、绿色木霉（Trichoderma viride）、绿黏帚霉（Gliocladium virens）、多孢木霉（Trichoderma polusporum），应用最多的为哈茨木霉，已有研究表明，哈茨木霉可以通过重寄生作用和产生抗生素抑制植物病原真菌并促进植物生长和诱导植物防御，其产生的抗生素包括聚酮类、氨基酸及其衍生物以及萜烯类、咪唑类等。

现有用来培养哈茨木霉的培养基为麦麸制剂（丰来等，CN 10333851 A）。

哈茨木霉一般先通过PDA培养基进行一级培养后，再将孢子洗脱后植入麦麸中进行二级培养，因而其培养周期长、成本高，而以生物质为原料培养哈茨木霉的研究鲜有报道。

秦泽荣等（CN 106191203 A）发明一种由携氧载体粉末和竹粉组成的用于哈茨木霉培养的选择性培养基，该技术通过提高哈茨木霉的供氧量提高生物量。

[0006]考虑到竹纤维与其他木质纤维素生物质酶法转化一样，竹材纤维对酶解反应的强抵抗力也是竹纤维生物转化的瓶颈。

纤维素酶先特异性地吸附在底物纤维素上，然后再对纤维素进行降解，所以如何降低纤维素的结晶度和尽可能的增大底物比表面积及成孔性是纤维素酶解难题。

竹材中含纤维素25%-45%，半纤维素20%-25%，木质素20%-30%，与当前研究较多的麦秆和稻草杆相比，竹材与二者的纤维素含量相差不大，而木质素含量较高；与硬木及软木相比，竹材的木质素含量与其基本相当，但纤维素和半纤维素含量较低，因此，以竹材为对象进行生物转化的研究具有一定的独特性。

造纸打浆处理是使纤维原料在通过相对运动着的纤维生壁和次生壁产生位移，并接着产生破裂，然后纤维吸水润涨、被切断，最后使细纤维化，其中盘磨是连续打浆工艺，对纤维原料进行盘磨预处理可以减小纤维原料粒度、增加原料比表面积，从而提高原料的生物利用效率。

[0007]
发明内容
[0008]解决的技术问题：本发明为了提高毛竹生物利用效率，提供一种哈茨木霉固态发酵基质及其培养方法。

[0009]技术方案：一种哈茨木霉固态发酵基质，按重量份的组成为：8~9份盘磨毛竹粉，2~1份麸皮和25份哈茨木霉液态发酵培养基。

[0010]上述盘磨毛竹粉由毛竹粉末过0.425mm筛，经FSP -300型高浓实验盘磨机盘磨4~5次，所得物料游离度达到170~180mL，烘干备用。

[0011]上述哈茨木霉液态发酵培养基每升的组成按比例为：葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，硫酸铵0.75g，麸皮水80g，其中麸皮水由100g 麸皮，900g 水，煮沸20分钟后过滤而得。

[0012]上述固态发酵基质培养哈茨木霉的方法，步骤为：将哈茨木霉固态发酵基质搅拌均匀后湿热灭菌，冷却至室温，接入5wt.%哈茨木霉培养液，置于28℃培养箱中培养一周。

[0013]优选的，上述培养箱的摇床转数150r/min，培养时间120小时
有益效果：本发明的有益效果为：（1）应用盘磨处理的毛竹配制固态发酵培养基，可以使哈茨木霉菌快速大量繁殖生长；（2）相对于传统的哈茨木霉固态发酵基质组成，该配方不使用玉米粉等粮食作物，并且大幅度减少了麸皮的用量，为哈茨木霉的培养提供了新的可行的原料选择。

[0014]
附图说明
[0015]图1为毛竹原料扫描电镜图；
图2为毛竹原料经盘磨处理后扫描电镜图；
图3为毛竹经盘磨处理后培养哈茨木霉的扫描电镜图。

[0016]
具体实施方式
[0017]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。

在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。

[0018]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

[0019]具体方法按以下步骤进行：
（1）哈茨木霉液态发酵
哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)，购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC 3.5488。

液体培养基配方：其组分与含量（每升培养基中所含的质量）为葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，硫酸铵0.75g，麸皮煮水（100g 麸皮，900g 水，煮沸20分钟，用四层纱布过滤）80g。

250mL三角瓶装液体培养基50mL，用接种环挑取少许哈茨木霉菌菌丝于灭菌的培养瓶中，置于28℃摇床，150r/min，振荡培养120小时。

[0020]（2）毛竹原料预处理
毛竹粉末过0.425mm筛，经FSP -300型高浓实验盘磨机盘磨4 ~ 5次，所得物料游离度达到170 ~ 180mL，烘干备用。

[0021]（3）哈茨木霉固态发酵
称取8
~9份重量的盘磨毛竹粉，2
~
1份重量麸皮和25份（1）中所述的哈茨木霉液体培养
基，搅拌均匀后湿热灭菌冷却至室温，接入5%哈茨木霉培养液，置于28℃培养箱中培养一周。

[0022]（4）哈茨木霉生物量测定
取0.5g固体培养物，用含1%吐温的无菌水稀释100倍，在磁力搅拌器上搅拌20min，用血球计数板在显微镜下计数孢子数。

[0023]实施例1
一种用于哈茨木霉固态发酵的基质和培养方法：（1）哈茨木霉菌液态发酵：哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)，购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC 3.5488。

液体培养基配方：其组分与含量（每升培养基中所含的质量）为葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，硫酸铵0.75g，麸皮水（100g 麸皮，900g 水，煮沸20分钟，用四层纱布过滤）80g。

250mL三角瓶装液体培养基50mL，用接种环挑取少许哈茨木霉菌菌丝于灭菌的培养瓶中，置于28℃摇床，150r/min，振荡培养120小时。

（2）毛竹粉末过0.425mm筛，经FSP-300型高浓实验盘磨机盘磨5次，烘干备用。

盘磨操作参数：螺旋转数280r/min，供水压力：0.5Mpa，冷却水流量：2L/min，稀释水流量3L/min。

(3) 称取9份重量的盘磨毛竹粉，1份重量麸皮和25份（1）中所述的哈茨木霉液体培养基，搅拌均匀后平铺于直径为14cm的培养皿中，湿热灭菌冷却至室温，接入5%哈茨木霉培养液，置于28℃培养箱中培养一周。

在接种48小时后每24小时将培养基质和菌丝混合均匀，并补充适量的无菌水。

（4）取0.5g固体培养物，用含1%吐温的无菌水稀释100倍，在磁力搅拌器上搅拌20min，用血球计数板在显微镜下计数孢子数。

在此条件下哈茨木霉的孢子产量为2.38×109个/g。

[0024]实施例2
一种用于哈茨木霉固态发酵的基质和培养方法：（1）哈茨木霉菌液态发酵：哈茨木霉菌(Trichod e rma ha rzia num)，购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC3.5488。

液体培养基配方：其组分与含量（每升培养基中所含的质量）为葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，硫酸铵0.75g，麸皮水（100g 麸皮，900g 水，煮沸20分钟，用四层纱布过滤）80g。

250mL三角瓶装液体培养基50mL，用接种环挑取少许哈茨木霉菌菌丝于灭菌的培养瓶中，置于28℃摇床，150r/min，振荡培养120小时。

（2）毛竹粉末过0.425mm筛，经FSP-300型高浓实验盘磨机盘磨5次，烘干备用。

盘磨操作参数：螺旋转数280r/min，供水压力：0.5Mpa，冷却水流量：2L/min，稀释水流量3L/min。

(3) 称取9份重量的盘磨毛竹粉，1份重量麸皮和25份（1）中所述的哈茨木霉液体培养基，搅拌均匀后置于20×28cm的菌菇培养袋中，湿热灭菌冷却至室温，接入5%哈茨木霉培养液，置于28℃培养箱中培养一周。

在接种48小时后每24小时将培养基质和菌丝混合均匀，并补充适量的无菌水。

（4）取0.5g固体培养物，用含1%吐温的无菌水稀释100倍，在磁力搅拌器上搅拌20min，用血球计数板在显微镜下计数孢子数。

在此条件下哈茨木霉的孢子产量为3.72×109个/g。

图1
图2
图3。