不同冻存条件对造血干细胞保存效果的影响

不同冻存条件对造血干细胞保存效果的影响作者：曹蕾么饶
来源：《健康周刊》2017年第40期
【摘要】通过移植造血干细胞可以治疗肿瘤、血液病、遗传病等多种疾病。

与骨髓、外周血相比，脐血中的造血干细胞含量丰富且便于采集，具有对 HLA 的配型要求不高、产生抗宿主症状的机率较低等优势。

但要有效利用其中的造血干细胞，脐血冷冻保存所产生的影响至关重要。

本文以新生儿脐带血为主要研究对象，就不同冻存条件对造血干细胞保存效果的影响进行简要分析，以期为脐血移植等造血干细胞应用技术提供一些参考。

【关键词】造血干细胞；脐血；冷冻保护剂；低温冻存
造血干细胞移植可以进行血液病、遗传病等多种疾病的临床治疗。

一般情况下，脐血等造血干细胞载体在采集后需要低温长期保存，不同的冻存条件对造血干细胞的数量和质量等会造成一定影响。

本文以新生儿脐带血样本为研究对象，在加入不同冷冻保护剂、采用不同冻存温度冻存样本的情况下分别进行实验，并分析对比冻存前后造血干细胞的變化。

一、材料准备
（一）采集脐血
2003 年 2 月 27 日至 2015 年 3 月 11 日，由具备相应资质的妇产医院采集 505 份新生儿脐带血。

脐带血采集对象均于足月后生产，且产妇无梅毒、艾滋病、乙型或丙型肝炎等传染病病史，无恶性肿瘤史，无遗传病、血液系统病等疾病，妊娠时无产科并发症。

新生儿脐带血采集在无菌环境中采用静脉穿刺法抽取，采集后先保存于 4℃冰箱，然后放置到脐血库中。

整个操作过程均在专用采集袋中完成。

（二）制备脐血
在脐血样本中加入 60g/L（体积 4：1）的羟乙基淀粉，117xg 离心 6.5min，将红细胞层（约 25 ml）、白细胞层、血浆层和压至样本保存袋；继续 791xg 离心 13min，并运用自动压浆板压出多余血浆，保留总量约 30ml 的脐血。

整体制备过程于采集脐血后的 18h 内完成。

（三）检测脐血
冻存脐血前均进行有核细胞数、CD34+ 细胞数、乙肝抗体、丙肝抗体、HIV 抗体、梅毒抗体等各项检测，经检测达到标准的样本，留取 1.8ml（作为没有进行冻存实验的对比组样本）[1]。

二、方法和结果
（一）加入不同冷冻保护剂冻存脐血冰水浴，从采集的脐血样本中选取等量的 30 份，标记为 A、B 两组，每组 15 份。

在每份样本中加入同样体积、与样本等量的冷冻保护液，A 组加入 5%的 DMSO，同时加入 HES，B 组只加入 10%的 DMSO，充分混合均匀。

将两组样品放置于同等温度下冻存，并于冻存 1 月、3 月、6 月后进行复苏，然后对两组样本的检测数据进行分析和比对。

检测结果表明，A 组细胞活率为： 96.3±1.2%，B 组细胞活率为：
92.2+3.8%，两组样本检测数据无显著性差异。

A 组（同时加入 5%的 DMSO 和 HES）冻存 6 个月之后的 CFU-GM 回收率达到 90.2±13% ，B 组（只加入 DMSO 保护剂）冻存 6 个月之后的 CFU—GM 回收率为 77.4±1.1% ，两组的 CFU-GM 回收率明显存在统计学差异，加入DMSO+HES 联合冷冻保护剂的 A 组明显优于单独采用 DMSO 冷冻保护剂的 B 组。

（二）采用不同温度冻存和复温脐血将脐血样本分Ⅰ、Ⅱ两组进行冻存。

在脐血样本中加入细胞冷冻保存液（10%的 DMS0、≥ 5%的人血白蛋白），然后用培养液（RPMI 1640）调整稀释，使每份干细胞浓度处于（1 ～ 3）×106/ ml 与（1 ～ 3）×108 / ml 之间。

依照上述比例配匀后，放置于 4℃冰箱中备用。

在每袋脐血中缓慢加入冷冻保护剂，同时缓慢晃动采集袋，使干细胞和冷冻保护剂混合均匀。

将混合后的干细胞采集袋分装到低温保存血袋（200ml 规格）中，放入 4℃冰箱静置 2h，然后放置到 -80℃的低温冰箱中。

同时用经过灭菌的低温保护管提取 1 份混合液，每袋提取 7 管，取其中 6 管放入 -80℃的低温冰箱中存放（简称Ⅰ组）；不进行程控降温，24h 后将其中 3 管移置到 -196℃的液氮罐中存放（简称Ⅱ组），1 管留做进行冻存实验的对比检测。

实验过程中专人定期进行液氮的补充。

将冻存标本从 -80℃冰箱和液氮罐中取出，快速放入 40℃的水浴箱进行复温，溶化后即刻取出进入数据检测环节。

实验结果：从冻存效果来看，与冻存前相比，Ⅱ组（即液氮组）冻存的干细胞在 1 年、2 年和 3 年后的细胞计数及细胞活性的差异均达不到统计学意义，Ⅰ组（即冰箱组）冻存的干细胞在 l 年、2 年和 3 年后的 MNC、 CD34+ 细胞计数与Ⅱ组（即液氮组）相比较，其差异也没有统计学意义（P>0.05）。

从细胞回收率来看，Ⅰ组（即冰箱组）的冻存干细胞单个核细胞的回收率在 2 年和 3 年后与 1 年后相比差异较小，达不到统计学意义标准（P>0.01）[2]。

与冻存 1 年时间后的干细胞相比较，Ⅰ组（冰箱组）冻存干细胞在 3 年后的细胞回收率的增高差异达到统计学意义标准（P
三、探讨
（一）冻存保护剂方面
注入 HES 可以有效进行脐血造血干细胞的冷冻保护，HES 与 DMSO 共同使用可以发生协同作用。

以 6 个月为最大冻存时长的研究数据显示：HES 联合 DMSO 的冻存保护效果优于单独使用 DMSO。

研究还表明，DMSO 联合 HES 冷冻保护体系更适用于 -80℃的非程控降温法，因其可以简化操作步骤，有效节省程控降温时间和设备费用。

但其长期冻存效果及保护机制还需进一步讨论和验证。

（二）低温冻存和复温方面
目前主要有 3 种造血干细胞的体外保存方法，即 4℃保存、- 196℃液氮和 -80℃冰箱保存。

4℃保存属非冻存保存，操作简便、成本低，但保存时间较短。

-196℃液氮和 -80℃冰箱保存均属冻存保存，-196℃液氮深低温冷冻保存能够长期有效地冻存干细胞，但对设备要求高，费用也比较昂贵。

-80℃冰箱冷冻保存简单经济，在临床上已逐步得到应用，但 3 年以上长期保存效果有待进一步研究和验证。

结语
综上所述，在 6 个月冻存期内，与单独注入 HES 相比，DMSO 联合 HES 冷冻保护剂对造血干细胞的冷冻保护效果更佳，但其长期冻存的效果及保护机制还有待验证。

在 1 ～ 3 年冻存期，-196℃液氮和 -80℃冰箱冻存干细胞的 MNC、CD34+ 细胞计数、细胞活性和干细胞回收率差异均无统计学意义。

冻存 3 年以上，- 80℃冰箱冻存下干细胞回收率的增高差异有统计学意义，-196℃液氮冻存下上述三项指标无明显差异，对造血干细胞质量影响极小，不会影响移植效果。

参考文献
[1] 章毅，朱华，金焕英等 . 液氮冻存时间对 605 份脐血造血干细胞质量和临床移植效果的影响 [J]. 中华血液学杂志，2015，36（1）：1-3.
[2] 黄璐，宋瑰琦，吴云等 . 深低温冻存不同时间对脐血细胞质量的影响 [J]. 中国实验血液学杂志，2013，21（1）：177-180.。