小麦抗病分子标记筛选及相关基因的生物信息学分析

山西农业科学2020，48（7）：1010-1015小麦抗病分子标记筛选及相关基因的生物信息学分析
史晨琳1,2,王长彪2,赵兴华2,刘
江2,韩
斌2,任永康3,牛瑜琦3,唐朝晖3
（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院生物技术研究中心，山西太原030031；
3.山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原030031）
摘要:近年来，小麦产量受到各种病原菌的威胁。

因此，揭示小麦与病原菌的互作机制，预测与小麦抗病相关的
重要功能基因以及生物学通路，对小麦抗病分子育种具有重大意义。

试验筛选出41个与小麦抗病相关的特异性分子标记，进行电子定位，并且通过GO 功能预测、功能注释获得抗病性相关基因，通过KEGG 分析揭示小麦在与白粉菌、锈菌互作中的相关功能基因的生物信息学和分子机制。

关键词:小麦；分子标记；电子定位；抗病基因；生物信息学中图分类号:S512.1
文献标识码:A
文章编号:1002-2481（2020）07-1010-06
Screening of Wheat Disease Resistance Molecular Markers and
Bioinformatics Analysis of Related Genes
SHI Chenlin 1，2
，WANG Changbiao 2，ZHAO Xinghua 2，LIU Jiang 2，HAN Bin 2，
REN Yongkang 3，NIU Yuqi 3，TANG Zhaohui 3
（1.College of Bio-engineering ，
Shanxi University ，Taiyuan 030006，China ；2.Research Center of Biotechnology ，Shanxi Academy of Agricultural Sciences ，Taiyuan 030031，China ；3.Institute of Crop Sciences ，
Shanxi Academy of Agricultural Sciences ，Taiyuan 030031，China ）
Abstract ：In recent years,wheat production has been threatened by various pathogens.Therefore,revealing the interaction mechanism between wheat and pathogens,predicting the important functional genes and biological pathways related to wheat disease resistance,it is of great significance for wheat disease resistance molecular breeding.In the experiment,41specific molecular markers related to wheat disease resistance were screened out,and electronic location was performed.The genes related to resistance were obtained through GO functional prediction and gene annotation.Through KEGG analysis,the biological information and molecular mechanism of the related functional genes in the interaction between wheat and pathogens were revealed.
Key words ：wheat;molecular marker;electronic PCR;resistance gene;bioinformatics
收稿日期:2020-03-08
基金项目:国家重点研发计划项目（2017YFD0101002）；山西省重点研发农业一般项目（201803D221018-6，201903D221094）作者简介:史晨琳（1994-），女，山西运城人，在读硕士，研究方向：
作物遗传育种。

唐朝晖为通信作者。

分子标记在小麦遗传育种中有着重要作用，
主要体现在遗传图谱的构建、基因标记和定位、品种鉴定和指纹图谱绘制、物种亲缘关系和遗传多样性研究及分子标记辅助育种等方面[1]。

分子标记包括
两类，一类是基于非PCR 技术或者杂交技术，
如RRFLP （限制片段长度多态性）
；二类是基于PCR 技术的任意引物或序列非特异技术，如RAPD （随机扩增多态性DNA ），AFLP （扩增片段长度多态性）
和序列靶向PCR 技术（如SSR ，SNPs ）[2]。

SSR 分子标记在遗传基础较窄的普通小麦基因组中随机分
布，具有多位点、丰富的多态性、
大部分位点有特异性，因此，在小麦的遗传育种研究中已广泛应用[3-4]。

SCHULER [5]于1997年第一次提出电子PCR
（Electronic PCR ，e-PCR ）的概念，
被用于DNA 片段染色体定位和基因组辅助作图等方面[6]。

电子克隆
技术是指在已有的网络资源和数据库（EST 、核苷酸
数据库、基因组数据库等）
中采用聚类、同源性检索、序列拼装等生物学方法，
利用计算机技术来延伸EST 序列，从而得到部分或者全长cDNA 序列的技术[7]，具有简单、快速、成本低等特点[8]。

随着小麦及其祖先种基因组测序工作的完成，产生了大量可分析数据[9]。

多种基因预测软件被用于预测各种生物基因结构及功能[10]，其中，Fgenesh
可用于真核生物的预测，
直接对某生物的cDNA 序列或蛋白质的相似性来预测，准确性极高[11]。

Blast2go 是一种利用GO 功能注释和分析的相似性
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史晨琳等：小麦抗病分子标记筛选及相关基因的生物信息学分析
搜索工具，便于对大批量功能基因组学信息进行搜索[12]。

通过大量的图形和分析工具来处理数据[13]，对
基因或蛋白质序列进行功能注释和分析，注释时对每个基因或基因产物生成一个与之相关的GO 术语列表[14]。

KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes ）即京都基因和基因组百科全书[15]。

KEGG 通路图用图形将基因、酶和各种代谢网络信息相结合，每个代谢途径构成一个含有酶或EC 号的网络[16]。

作为一个丰富的生物信息学资源库，KEGG 是基因功能预测、寻找基因涉及的代谢途径，挖掘代谢产物、基因、调节物质三者间关系的重要工具[17]。

本研究通过从已发表文献中寻找与小麦抗白
粉病、抗锈病相关的特异性分子标记，并进行筛选，将其定位在六倍体中国春小麦和祖先种乌拉尔图小麦、粗山羊草的全基因组数据库中，
对能够成功定位的序列进行功能预测、GO 功能注释以及KEGG 分析，获得与小麦白粉菌、锈菌互作过程中的基因表达信息，较全面认识基因在抗性反应网络中基因间的相互关系，为揭示小麦病害的发病机理、发掘和克隆抗病新基因和开发分子标记奠定基础。

1
材料和方法
1.1
试验材料
由山西省农业科学院作物科学研究所提供的
34份小麦材料：中国春、
乌拉尔图小麦（Triticum urartu ）、拟斯卑尔脱山羊草（Ae.Speltoides Tausch ）、粗山羊草（Aogilops.tauschii ）、野生一粒小麦（Triticum boeoticum Boiss ）、Sy95-71、运旱618、运旱20410、铭贤169、晋麦47、晋麦66、98M71、Moro 、先麦12、
丰尤8号、百农121、郑132、郑369、阜0608、良星99、济麦22、山农20、中麦247、良星66、宁麦5号、舜麦1718、百农64、皖麦38、MY559、兰考906、石
家庄8号、中麦175、长6878、周麦28。

从已发表的相关文献中寻找与小麦抗白粉病、
锈病的相关分子标记150个。

1.2试验方法1.2.1
标记筛选
在Linux 平台上将小麦抗病标记
在中国春及其祖先种乌拉尔图小麦（Triticum urar 原
tu ）、粗山羊草（A ogilops.tauschii ）中进行电子定位，确定其在染色体上的实际位置。

再通过PAGE 筛选，筛选出41个对小麦高感材料与高抗材料特异
性的分子标记。

1.2.2
生物信息学分析
对能成功进行电子定位
的位点，提取两翼各2000bp 的序列，进行了电子克隆。

使用Fgenesh 对相关定位位点的两翼序列进行功能基因预测。

为了深入的研究小麦相关抗病基因的分子机理和功能，
使用Blast2go 软件对获得的功能基因进行基因的GO 功能注释及KEGG 的代谢途径分析。

2
结果与分析
2.1
电子定位分析
统计电子定位结果，其中分别定位在六倍体小
麦的2B 染色体，乌拉尔图小麦（Triticum urartu ）的2号染色体，
粗山羊草（Aogilops.tauschii ）的2号染色体上的最多。

同一标记定位在不同染色体上，或者同一染色体不同位置。

2.2
与标记关联的基因预测
对能够成功定位位点的上游和下游分别提取2kb 的基因组序列，使用在线基因预测软件Fgenesh
对提取到的基因组序列进行基因预测，共预测出96个功能基因。

2.3
基因
功能注释
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山西农业科学2020年第48卷第7期
用B1ast2go软件把预测到的96个功能基因的DNA序列进行GO功能注释，其中，成功注释的有60个序列，未成功注释的有36个。

注释结果共有58条术语信息：参与生物学途径（P）的有24条，占41.38%；细胞组件（C）的10条，占17.24%；分子功能（F）的有24条，占41.38%。

功能基因二级水平的GO注释如图1所示。

2.3.1分子功能（F）GO术语分析参与分子功能（F）的功能基因有54个，分子功能二级水平包括结合、催化活性、营养库活性以及转运活性4种反应类型，其中，参与结合（42.2%）和催化活性（35.6%）这2种类型中的功能基因占多数，说明细胞内正常活动离不开包括催化活性、杂环化合物结合、有机环状化合物结合、离子结合、转移酶活性、核酸结合、催化活性，作用于蛋白质、营养库活性等。

其具体结果如图2所示。

2.3.2生物学途径（P）GO术语分析参与生物学途径的共有51个功能基因，生物学途径（P）二级水平中包括代谢过程、细胞反应、定位、细胞成分或生物发育、刺激反应、多生物反应、生物过程调控以及生物调控8种途径类型。

8种途径中参与代谢过程（29.0%）、细胞过程（26.9%）的功能基因最多。

代谢途径在植物与病原菌长期的共同进化过程中产生的复杂免疫系统中有着重要的作用，代谢过程中产生一系列产物，如水杨酸、植物凝集素以及次生代谢产物植保素、木质素、胼胝质，这些物质具有抵抗各种病原微生物入侵等提高植物抗病性的特点。

这
些基因参与细胞正常生命活动，在细胞增殖、分化、凋亡、迁移过程中起到重要的调控作用。

其具体结果如图3所示。

2.3.3细胞组件（C）GO术语分析参与细胞组件的相关功能基因共有59个。

细胞组件二级水平包括细胞组分、细胞、细胞器、膜、膜组分、蛋白复合物以上6种反应类型。

其中，在细胞（24.5%）、细胞组分（24.5%）、细胞器（19.4%）参与的功能基因最多。

植物细胞是其一系列生命活动的结构与功能的基本单位，从结构方面，可分为细胞壁、质膜、细胞核与细胞质。

细胞核是遗传物质储存和复制的场所、对细
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2.4KEGG 代谢途径分析
用KEGG 数据库对得到的96个功能基因进行
代谢途径分析，代谢KO 结果及对应基因序列如表1所示。

胞整体代谢和发育起重要作用。

植物细胞核中不同细胞器具有不同的作用，
比如，叶绿体是植物细胞能进行光合作用最重要的细胞器，
线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所。

这表明小麦功能基因的实现都是在细胞内发生，离不开细胞内各种细胞器和
细胞组分的相互作用。

其具体结果如图4所示。

史晨琳等：小麦抗病分子标记筛选及相关基因的生物信息学分析
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山西农业科学2020年第48卷第7期表1代谢通路及基因序列
KO编号K00430 K19041
K08235 K13456 K00002 K15382
K17302
K07088 K14849
定义
EC：1.11.1.7
RNF38_44，
EC：2.3.2.27
EC：2.4.1.207
RIN4
adh，EC：1.1.1.1
SLC50A，SWEET
COPB2，SEC27
uncharacterized
protein
RRP1
序列
R35_chr2：c15247710-15243542
S5_2A：729575149-729597382-2
R48_5A：c702503970-702499760-1
R60_5B：701460124-701464231
R56_Tu1：14506450-14510636-2
R07_6D：455131969-455136142-2
R07_chr6：479075589-479079762-2
R51_7B：c718434553-718430309-1
R51_Tu7：698386587-698390868-1
R16_chr5：c444385387-444381148
R16_5D：c440922940-440918701
S5_chr2：575741567-575745800
020_2D：595544128-595548276
S5_2D：595544071-595548304
020_2B：723440795-723444943
020_chr2：575741624-575745772
R35_chr2：c15247710-1524354定义为乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH，EC1.1.1.1），EC1.
1.1.1在原核生物、真菌、植物及动物中高度保守，可以将乙醇与乙醛相互转化，在抵御低氧、低温、涝害、干旱和盐胁迫等非生物胁迫过程中有着重要作用[18]。

R56_Tu1：14506450-14510636-2定义为过氧
化物酶（peroxidase，EC：1.11.1.7），EC：1.11.1.7功能多样，在植物抗逆、生长发育、遗传育种、木质素合成及其他生理过程中具有重要作用[19]。

李华琴等[20]试验表明，小麦感病品种的过氧化物酶活性比抗病品种的显著增强，并且酶活性的增强与叶片症状相关联。

R48_5A：c702503970-702499760-1定义为木葡聚糖内糖基转移酶基因（XET），XET通过改变木葡聚糖的结构引起细胞壁松弛，从而对植物生长发育产生影响[21]。

R07_6D：455131969-455136142-2（R07_chr6：479075589-479079762-2）定义为SWE-ET基因（sugars will eventually be exported transporter），SWEET家族参与宿主-病原菌之间的互作，但只有部分与病原菌互作的机理得到阐述，而病原菌特异性识别SWEET基因的途径是未知的[22]。

植物进化出用以监控、抑制病原菌效应子的R基因，宿主R基因与病原物致病性的无毒基因（Avr）相互作用下产生抗性，是引发宿主免疫反应的前提。

R60_5B：701460124-701464231定义为RIN4，RIN4在与植物病原菌相互作用中具有重要的作用，A vrRpm1和A vrB诱导RIN4磷酸化，可能会增强RIN4作为植物防御的负调节因子的活性，促进病原菌的生长[23]。

代谢通路如图5所示。

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··
3结论与讨论
本研究通过对筛选出的特异性分子标记，对提取到的基因组序列进行基因功能预测和注释，再使用Fgenesh预测出96个功能基因，对获得的基因序列进行GO功能注释以及KEGG代谢途径分析。

在GO注释结果中，生物学途径（P）与分子功能（F）的GO术语数目较多。

在生物学途径中，以代谢过程为主；细胞组件中，以在细胞和细胞器中起作用的为主；分子功能中，具有结合和催化活性功能的基因数目最多，说明获得的功能基因主要通过在细胞内，各种物质通过结合与催化功能进行代谢活动。

KEGG代谢通路分析得到了对应的KO代谢途径及EC编码等相关信息。

其中，R35_chr2：c15247710-15243542、R60_5B：701460124-701464231、R07_6D:455131969-455136 142-2（R07_chr6：479075589-479079762-2）可能与抗病相关联；S5_2A：729575149-729597382-2（S5_ chr2：575741567-575745800、S5_2D：595544071-59 5548304）、R48_5A：c702503970-702499760-1、R56_ Tu1：14506450-14510636-2、R51_7B：c718434553-718430309-1（R51_Tu7：698386587-698390868-1）、020_2D：595544128-595548276（020_2B：72344079 5-723444943、020_chr2：575741624-575745772）与植物抗逆性以及生长发育有关。

虽然通过生物信息手段预测到了和抗病相关的基因，但是这些基因在实际应用是否和抗病关联，还需要进一步进行功能验证，这为下一步进行小麦抗白粉病、锈病基因的定位及克隆、基因编辑和分子育种奠定了基础。

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(责任编辑:安清秀)
史晨琳等：小麦抗病分子标记筛选及相关基因的生物信息学分析
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