分化和DNA结合抑制因子1基因对MDA-MB-231乳腺癌细胞株MMP9表达的影响

分化和DNA结合抑制因子1基因对MDA-MB-231乳腺癌
细胞株MMP9表达的影响
许子志;王川;许东兴;蔡秀莺
【摘要】目的筛选成功转染Id1 miRNA真核表达载体乳腺癌MDA-MB-231细胞系,观察对乳腺癌细胞的对Id1、MMP9表达的影响.方法构建Id1 miRNA真核表达载体,转染乳腺癌MDA-MB-231细胞株以杀稻瘟霉素筛选稳定表达的细胞株.经RT-PCR方法鉴定其对Id1、MMP9表达的影响.结果经过筛选,获得转染Id1 miRNA真核表达载体稳定表达的MDA-MB-231细胞系.经RT-PCR方法鉴定,结果表明转染Id1 miRNA真核表达载体的乳腺癌MDA-MB-231细胞株其Id1、MMP9表达水平低于对照组,且Id1、MMP9表达水平正相关.未转染组与阴性对照转染组无明显差异.结论本实验成功筛选出稳定表达Id1 miRNA的乳腺癌细胞株,证实Id1 miRNA真核表达载体构建成功干扰有效,并且Id1与mmp9表达相关,为将来进一步研究他们之间的生物学行为差异,或详细了解其分子作用机制奠定了基础.
【期刊名称】《中国实用医药》
【年(卷),期】2013(008)019
【总页数】2页(P1-2)
【关键词】Id1;MMP9;真核表达载体;乳腺癌细胞株
【作者】许子志;王川;许东兴;蔡秀莺
【作者单位】351100,福建省莆田市第一医院乳腺甲状腺外科;福建医科大学附属协和医院乳腺外科;351100,福建省莆田市第一医院乳腺甲状腺外科;福建省莆田市涵
江医院妇产科
【正文语种】中文
Id1(Inhibition of DNA binding/differentiation)蛋白是一组缺乏碱性DNA连接结构域的HLH因子。

被认为是分化和DNA结合的抑制剂。

研究发现Id家族的蛋白在许多肿瘤中的表达是上调的[1-4]，研究证实其参与肿瘤的发生，与肿瘤细胞
的恶性转化、生长、浸润、转移相关[4]。

本实验室曾报道Id1与细胞增殖及血管
内皮生长因子表达的关系[5]。

本研究旨在探讨Id1基因与MMP9表达的关系，初步探讨Id1影响乳腺癌恶性生物学行为的机制。

乳腺癌细胞MDA-MB-232细胞株。

大观霉素。

Sc734-Id1单抗(兔源)，MMP9
单抗(兔源)。

lipofectamine2000脂质体转染试剂盒。

杀稻瘟霉素。

RT试剂盒
A3500。

Id1 miRNA干扰序列及阴性对照序列，质粒等[6]。

1.1 乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞的培养与传代确定杀稻瘟霉素筛选浓度为：
6ng/L。

1.2 以Lipofectamine2000及各重组质粒分别转染乳腺癌细胞MDA-MB-231细
胞株及以6ng/L杀稻瘟霉素稳定转染细胞株的筛选[6]。

1.3 RT-PCR法检测Id1 MMP9 mRNA表达。

1.4 免疫细胞化学方法检测Id1蛋白、MMP9蛋白表达：以MMP9(1 ∶ 100)和
Id1(1 ∶ 300)单克隆抗体检测、对比转染前后MDA-MB-231细胞株中MMP9及Id1蛋白表达。

2.1 在重组质粒Id1-pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体的细胞克隆中，重组的目的基因包含Id1 miRNA序列。

结果证实两组转染载体的细胞克隆中Id1
表达与其他组不相同。

稳定表达重组质粒Id1-pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR真核表达载体B，C的两组细胞克隆中Id1RNA的表达水平降低；整合negative control阴性对照载体的细胞克隆D组中Id1RNA的表达水平与无转染A组相似(见图1)。

2.2 实验结果证实转染重组质粒Id1-pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR真核表达载
体的细胞C组克隆中MMP9表达水平降低；整合negative control阴性对照载
体的细胞克隆B组中Id1RNA的表达水平与无转染A组相似。

2.3 转染前后Id1 1 ∶ 300稀释度下在胞浆可见程度不同阳性表达，PBS阴性对照仅见核被苏木素染色。

在重组质粒Id1-pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表
达载体的细胞克隆中，重组的目的基因包含Id1 miRNA序列。

结果证实转染载体的细胞克隆中Id1表达明显减弱(见图3、4、5、6)。

2.4 转染前后MMP9 1 ∶ 100稀释度下在胞浆可见程度不同阳性表达，在重组质
粒Id1-pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体的细胞克隆中，重组的目
的基因包含Id1 miRNA序列。

结果证实转染载体的细胞克隆中MMP9表达明显
减弱。

(见图5、6)
乳腺癌的浸润，转移是导致许多女性死亡的重要原因。

Id1过度表达与乳腺癌发生、发展、浸润、转移关系密切。

Id1蛋白可以通过多条途径影响CyclinD1的表达，
推动细胞周期由G1期进入S期，通过MAPK途径促使下游早期生长反应基因转
录和翻译的增加，促进细胞增殖[7]。

致细胞侵袭性和迁移性增加，使其通过基底
膜的侵袭力大大提高，Id1可能通过影响乳腺组织基质金属蛋白酶(MMP)，促进
乳腺癌细胞的侵袭、转移等。

[8]
MMP9是基质金属蛋白酶家族一员。

参与肿瘤转移等病理过程。

通过对肿瘤浸润
和转移的机制研究发现细胞外基质(ECM)在肿瘤的的浸润和转移过程中起着关键的作用[9]。

肿瘤细胞侵袭、转移能力与其诱导产生降解ECM、基底膜的蛋白酶的能
力密切相关，肿瘤细胞分泌的基质金属蛋白酶能够降解ECM，从而促进肿瘤的浸
润和转移[10]。

本研究通过构建miRNA真核表达载体，转染MDA-MB-231乳腺癌细胞株，成
功抑制Id1基因表达。

研究同时发现其也可以抑制MMP9的高表达，提示Id1与MMP9之间存在一定的内在联系，MMP9可能是Id1作用通路中的下游因子，其功能的实现可能受到Id1的调节。

Id1可能通过影响MMP9表达促进肿瘤细胞分
泌基质金属蛋白酶降解细胞外基质，促进肿瘤的浸润和转移。

另肿瘤的发生，发展及侵袭过程必然伴随着新生血管的生成， VEGF被认为是最主要，最特异性的一
种内皮细胞生长因子。

本实验室既往研究证实Id1与乳腺癌增殖及血管生成的行
为有关[5]。

综合提示Id1可能通过调节MMP9、VEGF等下游因子推动细胞周期
参与肿瘤的发生，发展，侵袭，转移过程。

综上所述，Id1基因与乳腺癌细胞增殖、侵袭、转移等生物学行为存在密切的关系，这可能是导致乳腺癌预后不良的生物学基础，其详细的机制值得进一步深入探究。

我们设想通过抑制Id1的表达可以相应的降低肿瘤的恶性程度，抑制肿瘤细胞的
浸润和转移，可能为乳腺癌的治疗开辟了一个新途径。

【相关文献】
[1] Prognostic relevance of Id-1 expression in patients with resectable esophageal squamous cell carcinoma. Luo KJ, et al. Ann Thorac Surg, 2012,93(5):1682-8. PMID 22480390.
[2] Swarbrick A, Akerfeldt MC, Lee cs, et al. Regulation of cyclin expression and cell cycle progression in breast epithelial cells by the helix-loop-helix protein ID1.oncogene,2005,
24(3):381-389.
[3] Vandeputte DA， Troost D， Leenstra S， et al. Expression and distribution of Id helix-loop-helix proteins in human astrocytic tumors. Glia，2002，38(4)：329-338.
[4] Yokota Y， Moil S. Role of Id family proteins in growth contro. J Cell Physiol，2002，190(11)：21-28.
[5] 王川，洪天姿，张捷，郭雯珲，傅芳萌，卢辉山.分化和DNA结合抑制因子1基因对乳腺癌细胞株MCF-7增殖活性及分泌血管内皮生长因子的影响.中华实验外科杂志，2012，29(5)：841-843.
[6] 许子志，王川.Id1 miRNA表达载体构建与转染乳腺癌细胞.中国实用医药，2009,4(10)：8-10.
[7] Cyclin D1, Id1 and EMT in breast cancer. Tobin NP, et al. BMC Cancer, 2011 Sep
28;11:417.PMID 21955753.
[8] Caldon CE, Swarbrick A, Lee CS, Sutherland RL, Musgrove EA. The helix-loop-helix protein Id1 requires cyclin D1 to promote the proliferation of mammary epithelial cell acini. Cancer Res, 2008, 15,68(8):3026-36.
[9] MMP-2 and MMP-9 in normal mucosa are independently associated with outcome of colorectal cancer patients. Langers AM, et al. Br J Cancer, 2012,24,106(9):1495-8.PMID 22472880.
[10] Olson M W, Bernardo M M, Pietila M, et al. Characterization of the monomeric and dimeric forms of latent and active matrixet alloproteinase-9. JBiol Chem,2000,275:2661-2668.。