菌株及质粒

菌株及质粒
常用菌株一览表
BL21（DE3）该菌株用于高效表达克隆于有T7噬菌体启动子的表达载体的基因。

T7
噬菌体RNA聚合酶位于噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。

天然缺失外膜蛋白
酶ompT和ATP依赖的蛋白酶Lon（La），利于异源蛋白的表达。

在培养皿上的生长时间约为10小时左右。

ER2566 该菌株用于高效表达克隆于有T7噬菌体启动子的表达载体的
基因。

在培养皿上的生长时间约为10小时左右。

DH5α一种用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷的抑制型菌株。

其
80lacZΔM15基因的产物可与pUC载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，即可以
用于蓝白斑显示。

该菌株也缺失多种蛋白酶，在培养皿上的生长时间约为12小时左右。

JM101 一种可支持带有琥珀突变的载体生长的宿主菌，在培养皿上的生长时间约为
10小时左右。

JM109 一种带有琥珀突变的载体生长的重组缺陷的抑制型菌株，对转染的DNA有修
饰作用但无限制作用，在培养皿上的生长时间约为10小时左右。

HB101 一种通常用于大规模制备质粒的抑制型菌株，它是一种转化效率很高的大肠
杆菌K12×大肠杆菌B的杂交菌株，在培养皿上的生长时间约为10小时左右。

常用原核表达质粒一览表
质粒名称 pRSET p24B11 pTYB pGEX pET pTRX-Fus pBV pMAL 实验室系列数 3 1 4 6 2 1 2 2 启动子 T7 T7 T7 Ptac T7 PL PL Ptac 大小 (Kb) 2.9 5.4 7.3 4.9 4.7 3.5 / 6.7 抗性标记 Ap Kan Ap Ap Kan Ap Ap Ap 融合蛋白大小(kD) 3-5 kD 0-1
kD 55 kD 26 kD 3-4 kD 11 kD / 43 kD 诱导物 IPTG IPTG IPTG IPTG IPTG Trp 420C IPTG
? 如何提高目的蛋白在大肠杆菌中的表达量及可溶性表达？如何防止目的蛋白的降解？
融合蛋白的表达水平主要受目的蛋白影响、密码子不适、疏水性强、mRNA降解、或由于蛋白错误折叠而水解都可能造成表达水平低，可尝试不同的生长和表达条件来提高融合
蛋白的表达量，低温诱导可降低包含体的形成及避免水解；运用最适密码子可提高表达；
也可能由于目的蛋白对宿主细胞有毒性而使克隆不稳定。

故表达时可利用丰富的培养基、
新鲜的单菌落、低温诱导、低浓度的IPTG、减少诱导时间等条件来提高蛋白及可溶性蛋白的产量。

蛋白酶抑制剂，蛋白酶缺陷的工程菌或者低温诱导可防止目的蛋白降解，纯化时
为防止降解可使用变性条件，如6M脲等。

pMAL纯化系统
pMAL-p2为分泌型表达载体，表达的融合蛋白分布于大肠杆菌外周腔，用冷渗透法即
可获得较纯的融合蛋白。

pMAL-c2表达的可溶性融合蛋白多位于大肠杆菌细胞质中，可按
常规方法进行纯化。

二者均为Ptac启动子，大小约为6.7Kb，唯一不同的是pMAL-c2
无malE 信号序列。

MBP的分子量为43KD。

介质�D�Damylose resin，与麦芽糖的结合能力大于3mg/ml。

pMAL-p2的纯化
1) 用1L的培养基表达目的蛋白，离心后用400ml的30mM Tris-HCl， 1mM EDTA，
20%蔗
糖pH8.0的缓冲液悬浮，室温下轻轻摇动5-10min。

2) 4℃，8000g离心20min，弃去上清，加入400ml冰预冷的含5 mM MgSO4柱缓冲液
悬浮，冰
浴摇动10min。

3) 4℃，8000g离心20min，上清即为冷渗透的溶液。

4) 在上清中加入8ml的1M
Tris-HCl (pH7.4)。

5) 用8倍体积的柱缓冲液平衡介质。

6) 上样，结合30min。

7) 用12倍体积的柱缓冲液平衡介质
8) 用3ml的洗脱缓冲液(含10mM的麦芽糖的柱缓冲液)洗涤多次(10-20次)，一般情
况下目的蛋
白集中在前5个收集峰中。

pMAL-c2的纯化
1) 用1L的培养基表达目的蛋白，离心后用40ml的柱缓冲液悬浮。

2) 超声处理样
品，离心后收集上清。

3) 以下方法按pMAL-p2的步骤5--8进行。

所需培养基及缓冲液
①丰富培养基每升中含10g tryptone
5g yeast extract 5g NaCl 2g
glucose
②colume buffer: 20mM Tris-HCl ( pH7.4 ) 200mM NaCl
1 mM EDTA
③elution buffer: colume buffer +10 mM maltose(麦芽糖) ②和③可加入
1mM的NaN3以长期保存。

介质的再生
介质可以重复利用3---5次，介质的再生应在4℃进行，方法如下:
用3倍体积的柱缓冲液洗涤-----含0.1%SDS的柱缓冲液洗涤------1倍体积的水洗涤-----3倍体积的柱缓冲液洗涤
pTYB纯化系统
原理
IMPACT，即用亲和几丁质作结合标签并由intein介导的纯化，它是一种用亲和标签一步层析法的新型重组蛋白系统。

该法是由NEB 在研究蛋白拼接机制时发现的。

它不同于其它纯化系统，仅需单一亲和柱，无须蛋白酶作用，便可用自身序列对重组蛋白进行切割、纯化。

.该系统利用工程化的蛋白拼接元件( intein )的诱导性自我切割能力使靶蛋白与亲和标签分离，编码目的基因的基因插入IMPACT表达载体的MCS，使目的基因与intein基因读框一致。

编码Bacillus circulans 几丁质结合区（CBD，52aa）已被克隆入intein下游且与其读框一致，以便对融合蛋白进行亲和纯化。

用大肠杆菌表达系统的粗提液过几丁质柱时，目的蛋白-intein-CBD融合蛋白结合于几丁质珠，而其它的杂蛋白则顺穿透峰流下，可用还原剂如 dTT、2-巯基乙醇等进行在柱剪切加工，intein-CBD结合在柱上而目的蛋白得以释放，即完成单一亲和柱对目的蛋白的纯化。

IMPACT-CN试剂盒
载体包括4个Ecoli表达载体pTYB1、pTYB2、 pTYB11和 pTYB12，可切割的intein标签可融合于目的蛋白的C端或N端，intein来自酿酒酵母VMA1基因。

C端融合载体pTYB1、pTYB2，利用454aa 的SceVMA intein，intein经过了修饰，用巯基试剂如DTT诱导时，其N端可发生断裂。

pTYB1、pTYB2以位于MCS NdeI的ATG作为转录起始位点，编码目的蛋白的基因插入MCS即可建立目的基因的C端与intein N端的融合蛋白，CBD 位于intein的C端。

pTYB11、pTYB12与pTYB1、pTYB2相反。

pTYB11 和pTYB1含SpaI位点使目的基因与intein标签直接相连，使纯化出来的目的蛋白不带有任何载体来源、非自身的外源氨基酸。

pTYB12和pTYB2表达的蛋白在用intein剪切后，获得的目的蛋白在分别在其N端或C端带有载体来源的残基。

除此, pTYB12和pTYB2 的MCS 上还带有相同或相容的内切酶位点，以便intein与同一目的基因N端或C端融合。

这样可使提高构建融合蛋白时的灵活性，使目的蛋白的表达与纯化的成功率得以提高。

Intein-CBD融合蛋白分子量为55KD，载体分子量约7.3Kb。

E.coli菌株ER2566 遗传背景与BL21（DE3）相似，含编码T7 RNA聚合酶基因，该系列融合表达载体适于在以上两种菌株中表达，不适用在DH5α和JM101中表达或扩增质
粒。

几丁质珠(介质) 几丁质珠结合麦芽糖结合蛋白的能力为2mg/ml, 几丁质珠应置于4℃，暂时置于-200C不会影响其结合能力。

几丁质珠(质珠)的再生可以再生4-5次，用colulm buffer在室温下平衡后，用3
倍柱体积的1%SDS溶液或6M的盐酸胍处理，接着5倍体积ddH2O洗及5倍体积colulm buffer洗涤，此后可用含0.02%NaN3的colulm buffer置于4℃保存。

抗CBD血清提供50微升抗CBD兔血清，1:5000稀释用于分析初纯样品。

DTT 30-50mM的DTT进行在柱洗脱，40C过夜洗脱效果最好。

IMPACT纯化步骤
1 1:100用10ml扩种到1000 ml的LB培养基中37℃温育止OD600值到0.6―0.8。

2 30℃诱导3小时或22℃-25℃诱导6小时或12-15℃诱导过夜，IPTG的浓度为0.
3 mM。

3 细胞收获4℃，5000g离心10min。

4 2
5 ml的colulm buffer 悬浮细胞，40s×9超声处理。

5 几丁质柱的平衡：几丁质介质的结合能力约为2mg/ml,加6ml 的几丁质介质用于
纯化表达体积为1L的目地蛋白，用60ml的colulm buffer洗柱。

6 以0.5ml/min 的速
度上样，暂时保存穿透峰。

7 用100ml的colulm buffer洗柱，速度为1ml/min。

8 堵住柱下口,快速用18ml的50mMDTT(新鲜配制)浸润介质，4℃过夜剪切。

9 目的蛋白洗脱：用6ml不含DTT的Cleavage buffer洗脱3次，按1ml 为单位收
集18管，用Bradford 实验分析蛋白浓度，而后电泳分析纯度。

10 融合前体的洗脱：用1%的SDS溶液洗脱残存的intein tag 及未融合的前体，吸
出200 微升chitin 树脂(介质)，加100微升3×SDS-PAGE loading bubber，煮沸2分
钟后取上清上样。

Lysis buffer 20 mM Tris-HCL pH 8.0
500 mM NaCL (50-1000 mM 间的NaCL 可调) 1 mM EDTA
0.1%Triton X-100 Colulm buffer 20 mM Tris-HCL pH 8.0
500 mM NaCL (50-1000 mM 间的NaCL 可调) 1 mM EDTA
Cleavage buffer 20 mM Tris-HCL（ pH 7-9 for pTYB1和pTYB2 ，pH 7.5 for
pTYB11
和pTYB12） 500 mM NaCL (50-1000 mM 间的NaCL 可调) 1 mM EDTA 50 mM DTT
Stripping buffer 20 mM Tris-HCL pH 8.0
500 mM NaCL (50-1000 mM 间的NaCL 可调) 1% SDS
GST纯化系统
Glutathine Sepharose 4B 特性
配体密度：每ml凝胶含7--15μmol的 glutathine（谷胱甘肽）
结合能力：每ml凝胶可结合大于5mg的马的肝脏的谷胱甘肽巯基转移酶最大工作压力：80cm水柱
最大排阻分子量：2 × 107 Daltons
谷胱甘肽巯基转移酶（GST）MW--26KD，位于N末端缓冲液1×PBS: 140mM NaCl
2.7mM KCl 10mM Na2HPO4
1.8mM KH2PO4( pH 7.3 )
谷胱甘肽洗脱缓冲液: 10mM还原型谷胱甘肽
50mM Tris-HCl ( pH8.0)
在柱纯化法（小量样品）
1 →轻摇介质瓶，使介质Glutathine Sepharose 4B混匀，吸取1.33ml介质浆（介质比为75%，即1.33ml体积介质浆中含1ml介质）上柱。

2 →轻敲柱子除去气泡，让柱子自然流干。

用10ml 4℃预冷的1×PBS平衡柱。

3 →堵住下样口，上样（即超声上清。

一般情况下，超声上清应先用13000 rpm，离心10min，然后用0.45μm的滤膜过滤）室温下孵育30min，其间应不断轻摇柱子，以达到良好的结合效果。

4 →打开下样口，让穿透峰自然流下（一般应收集穿透峰），让柱子流干。

5 →用10ml 4℃预冷的1×PBS洗柱，重复3次。

6 →堵住下样口，加入1ml的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温下孵育10min，其间应不断轻摇柱子，以达到良好的洗拖效果。

打开下样口，用1.5ml的离心管收集样品。

7 →重复步骤6多次，直到用力摇样品时观察不到气泡时为止。

离心纯化法（大批纯化）
1．介质用1×PBS平衡后，从柱子中转移到50ml离心管中，加入上清样品，室温下温和摇动30min，使目的蛋白与介质充分结合。

2． 500g ，离心5min沉淀介质，轻轻地吸出上清（穿透峰）。

3．加入10ml 4℃预冷的1×PBS平衡介质， 500g ，离心5min沉淀介质，小心地弃去上清。

4．重复步骤3两次。

5．加入1ml的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温下孵育10min，其间应不断轻摇离心管。

500g ，离心5min，小心吸出洗脱的样品。

6 重复步骤5多次，直到用力摇样品时观察不到气泡 (蛋白质为两性电介质，适当浓度时会产
生气泡) 时为止。

介质的再生
按3倍体积（ 3ml ）的高pH值（0.1M Tris-HCl + 0.5M NaCl pH 8.5）和低pH值（0.1M NaAc+ 0.5M NaCl pH 4.5）的顺序洗涤介质3次，最后用3ml―5ml的1×PBS缓冲液平衡介质3次。

如果介质失去结合能力，可能是由沉淀、变性或非特异性的结合蛋白的积累造成。

欲除去之，可用2ml的3M的盐酸胍洗介质，随后立即用5ml的1×PBS清洗介质。

欲除去疏水性结合物，可用3―4ml的70%的乙醇洗或者用2ml的0.1%的非离子型去污剂洗，随后立即用5ml的1×PBS平衡介质。

欲长期保存介质，可按下述办法处理介质：用10ml的1×PBS洗两次―--用20%的乙醇洗涤多次�D--用20%的乙醇保存介质―--使用前用1×PBS平衡。

感谢您的阅读，祝您生活愉快。