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酵母菌中多倍体基因组的基因分析
多倍体，即染色体成套的增加，在发育，细胞应激，疾病和进化中出现。

尽管多倍体现象很普遍，但很少有人了解伴随着多倍体的生理变化。

我们之前描述过“多倍体特异性致死”，在单倍体或二倍体出芽酵母不具有致死性的基因缺失对于三倍体或者四倍体酵母来说却具有致死性。

这里我们研究基因组是为了明确多倍性特异性致死的作用。

在被检测的3740个突变中只筛选出39个表现出多倍体特异性致死现象，几乎所有的突变都是通过损害同源重组、姐妹染色单体的结合或者有丝分裂纺锤体的功能来影响基因组的稳定性的。

我们发现被检测的野生型四倍体的缺陷，并且明确了四倍体影响基因组稳定性的机制。

我们发现四倍体有较高的发生率去附着纺锤体的单极，我们认为这个缺陷可以用错配来解释以扩大纺锤丝极体、纺锤体和着丝粒的限度，因此，几何约束可能对基因组的稳定产生深远的影响，在这里描述的现象可能与多种多样的生物演化关系相关，包括像癌症这样的疾病。

多倍体在自然界中很常见，所有生物体的多倍体现象发生在植物，真菌，无脊椎动物以及像鱼和两栖动物这样的低等脊椎动物中。

原因尚不清楚，但多倍体在高等脊椎动物中是不能存活的，我们认为多倍体现象在进化中也经常发生。

基因组序列表明，很多同时代的基因组，包括高等脊椎动物的基因组，是由原始的基因副本进化而来，保存了基因顺序和方向的复制的基因组片段在很多酵母菌和人类的基因组都是很明显存在的，这些发现与Ohno的假设是一致的，这个假设是：基因复制产生了进化多样性的基础。

多倍体也会在另外一些整倍体有机体的一小部分细胞中发生。

在绝大多数环境下，细胞在特定的机制——核内周期——的作用下会变成多倍体，它截断了细胞周期并且阻止了细胞分裂。

然而，一些细胞类型，像肝细胞，能够像多倍体细胞一样分裂，并且很多细胞类型在病态的情况下变成多倍体，以便在病毒感染之后或者处于像癌症这样的病态时对细胞应激做出反应。

因此，多倍体只出现在特定的细胞类群以及生理环境下，至少在发育过程中，存在一些机制来限制多倍体细胞的分裂。

多倍体具有一些潜在的优势。

伴随体积的增大，多倍体可提供代谢方面的好处。

比如，大肠杆菌在限制营养素的环境中能够自发地变成多倍体，原则上基因重复能够保护多倍体细胞防止有害的突变，尽管在测试时，它不能抵抗DNA破坏性物质。

然而，多倍体也有代价，特别地，新组建的多倍体经常显现在保持基因稳定方面的缺陷。

四倍体出芽酵母在DNA破坏机构或者微管动摇药物的处理后表现出较高比率的染色体损失以及较高水品的突变和重组，在很多四倍体动物细胞中，可以发现在胞质分裂失败或细胞融合后出现的不正常的有丝分裂导致的染色体错误的分离。

基因不稳定的四倍体细胞可能促进肿瘤发生，这个观点是我们最近用老鼠乳腺上皮肿瘤发生的模式确定下来的，新形成的多倍体细胞基因组的不稳定能够加速新的变体的产生，在生物进化以及肿瘤形成发挥的作用之间增加平行分支。

尽管基因组的不稳定通常与多倍体相联系，潜在机制我们并不了解，更广泛地说，伴随着多倍体生理变化的范围还不是很清楚。

我们以前识别的遗传现象，为我们提供了一条探寻这些问题的实验的道路，我们发现编码微管/着丝粒结合蛋白Bikl的基因的缺失会导致“多倍体特异性致死”，但是Bikl⊿的单倍体或是二倍体是可以存活的。

多倍体特异性致死现象表明伴随着多倍体会发生显著的生理变化，定义生理变化的第一步来自多倍体，我们设计了基因组策略来鉴别多倍体特异性致死作用，检测结果揭示了四倍体细胞有一个强大的特定的对一小组涉及维持基因组稳定性的基因的需要。

四倍体细胞最显著的缺陷在有丝分裂时，我们认为有丝分裂的缺陷能够至少一部分由纺锤体组分大小不匹配来解释，因为几何约束自然减少了染色体分离的准确度。

多倍性特异性致死的基因检测
我们开发出一个策略来制造出芽酵母菌株二倍体纯合子基因缺陷组成的四倍体衍生物。

基因替换盒是用来删除接合型MATa或者MATα位点将不接合的MATa/α转变成具有接合能力的MATa/⊿或者MAT⊿/α双倍体，从它们中我们可以筛选出四倍体。

使用这个策略，我们从存活的4766个双倍体纯合子基因缺陷中获得了3421对MATa/⊿MAT⊿/α缺陷菌株（占可存活的酵母基因缺陷的71.8％）并通过两两配对来分析。

我们识别出了酵母菌四倍体存活所需的17个基因，缺少这些基因的多倍体特异性致死已经被质体交换的方法独立地验证，这就证明了突变菌株在鉴定中得分，是因为四倍体的致死性和降低了的适应性而不是因为杂交的缺陷。

至少两类突变不能由我们的方法得到：必需基因和缺少同源重组的突变（由于MAT位点的无效的替换）。

我们因此使用了质粒交换的方法来构建四倍体菌株。

对于必需的基因，我们注重由基因组检测识别出来的功能相关的基因，因此对这些基因的特征描述就不具有广泛性。

我们分析了热敏突变在不同中温下的生长缺陷。

这些方法综合起来我们从3540个基因中识别出39个基因，这些基因是对四倍体酵母菌株的存活来说是必需的。

典型的基因缺陷也在不同压力环境下多倍体特异性致死类型中检测出来，这些分析证明了多倍体特异性致死在Saccharomyces cerevisiae来说是一个普遍现象，我们将参考所有突变，不管是在四倍体中具有致死性还是导致热敏生长的，都作为多倍体特异性致死突变。

在四倍体酵母菌中，对某些特定基因的强烈需求不可能是由于基因表达中多倍体特异性的变化。

野生型MATa/α二倍体的第三份样本和MAT a/a/α/α四倍体的比较不能解释二倍体和三倍体在基因表达方面显著的不同，这是从选择蛋白所用的不变的蛋白水平的特征描述来确定的。

这个结果表明一定有潜在的其他机制，不同于我们在四倍体中观察到的特定的变化，引起我们对野生型二倍体和四倍体细胞基因组稳定性的详细比较。

四倍体中基因组的稳定性
很显然，多数多倍体特异性致死基因形成三种功能群：以同源重组来修复DNA损伤所需的基因，姐妹染色单体结合成立与解除所需的基因，以及一小群有丝分裂纺锤体正常作用所需基因。

这些基因不仅仅涉及到基因组稳定性的维持上，而且这些基因之间也具有广泛的遗传性相互作用。

这些基因之间功能的相互联系被我们进一步的遗传性分析所证实。

多倍体特异性致死突变中非常小的特殊的群组表明改变了的基因组的稳定性是多倍体出芽酵母中主要的生理学变化。

接下来我们使用遗传性试验来系统地分析野生型多倍体基因组稳定性的特征。

通过检测酵母人造染色体的分离，我们观察到四倍体相比于二倍体染色体缺失的速度增加了200倍，这与之前的结果是一致的，证明了染色体错误分离在酵母菌四倍体中显然是很常见的。

尤其是相比二倍体，四倍体表现出同源染色体之间基因交换频率的增加（被检验为两种异等位基因的重组），此外，我们在分析酵母菌人造染色体标记基因的重排的试验中观察到了总的染色体重排频率小的但很重要的增长，比较之下，正向突变率和姐妹染色单体交换的频率在二倍体和四倍体细胞中是非常相似的。

总的来说，相比于二倍体，四倍体表现出大量的染色体的缺失以及变化了模式的重组，但是没有表现出一般的“高度重组”，以及高度突变的表现型。

四倍体的药物敏感对比曲线与这些发现是一致的。

与二倍体比较起来，野生型四倍体对双链断裂诱发性物质与微管毒物苯来特的敏感度表现出5到10被的增加，但是对压力，紫外管线或者放射性破坏不是很敏感。

四倍体为了存活下来要进行同源重组
单倍体和二倍体酵母，不同于动物细胞，不需要为了存活而进行同源重组，但是四倍体最突出的需要就是同源重组基因，从而显现出加高水平的自发DNA损害，尤其是要假设细胞周期特别是s期的时间不随倍数的增加而增加。

能够被同源重组修复的DNA损害的主要来源之一是DNA复制，一种可能性是没有任何DNA复制缺陷的，增加了数目的成套染色体能够制造足够的自发的DNA损伤，从而满足了同源重组的强大的需求。

为了检验这个假设，自发的DNA损伤能够通过双倍体或者多倍体表达Ddcl-GFP融合蛋白中被直接看到。

Ddcl是9-1-1化合物的组成成分，在DNA损伤的早期出现。

在单倍体中，Ddcl焦点在s期出现并且在细胞分裂的后期消失，与我们的假设相一致，具有Ddcl焦距的处于S期的细胞数目（小的胚细胞）与细胞多倍体的倍数呈比例，不管在每个细胞中焦距数目还是具有焦距的细胞的比例上，我们都观测到了1N，2N和4N细胞数目分等级的增加，这与减数分裂的细胞相对比，这些细胞中四倍体的Ddcl焦距比预期要高（按照染色体含量来看）。

这表明了细胞分裂期持续的DNA损伤以及发生在细胞分裂中或者是次级细胞群中额外的DNA损害，被短暂地阻止，来修复s期中所需要的基因的损伤。

为了进一步地检测这个观点：染色体组数目的增加与自发地DNA 损伤成比例，我们检测了不同倍体的同基因型的细胞（缺少Rad52），Rad52在出芽酵母同源重组中需要。

仅仅一组双链的断裂就会激活DNA损伤检查点，致使细胞周期停滞在rad52⊿，如果在s期，一小部分细胞需要自发的不能被修复的双键断裂，那么rad52⊿菌株的生长缺陷就可以被解释。

缺少Rad52的四倍体细胞在240℃生长缓慢，在30℃下是不能存活的，因此增加的多倍体的组数也能成比例的增加自发的双链断裂的细胞的数目。

可能绝大多数在37℃的四倍体细胞获得了一种损害，这种损害需要同源重组才能修复。

与我们的假设一致，缺少Rad52的细胞转换到37℃时会在s期之前被阻止为一种大的发芽细胞，但在s期完成之后发生的温度转变将不会发生这种现象。

为了直接验证这个假说，小的出芽rad52⊿和控制细胞被显微操纵技术分离，并且在随着细胞周期前进的时间中被检测，在30℃（这个温度可以对rad52⊿四倍体半许可），99％的野生型2N，3N，和4N细胞在4小时内完成细胞周期，相比之下，17％的2N，28％的3N 和48％的4N的rad52⊿细胞经历了更为长期的细胞周期。

有形态学表明，DNA损伤位点的活性，被阻止的细胞的线性增加支持了这一观点，具有自发的DNA损伤的细胞数目的增加与多倍体倍数成正比。

与这个假设一致，我们不能在其他过程中检测出缺陷，这个过程可以另外产生一些双键断裂。

野生型四倍体经过很多世代后产生了许多长的染色体终端，与二倍体的相同。

我们并没有观察到四倍体细胞周期前进过程和DNA复制过程的其他主要的缺陷，都通过从同步的细胞孤立出来的染色体的流式细胞术和脉冲区的电泳。

我们也没有在四倍体中观察到对诸如Cdc7、Cdc6 或者Pol32这样的复制蛋白的更多的需要。

综合考虑，这些结果阐明了一个“生死攸关”的门槛是如何通过增加染色体的数目来交叉到其他种群的细胞中去的。

因此酵母菌中的四倍体产生了一种这样的情景：就像在动物细胞观察到的那样，同源重组对于s期的完成是非常必要的。

四倍体姐妹染色单体结合的必要条件
接下来我们将介绍四倍体细胞中姐妹染色单体结合的必需条件，这首先决定了野生型的四倍体细胞是否具有结合缺陷。

姐妹染色单体结合被检测到在不同染色体IV位点上发生，通过诺考达唑阻止的细胞的GFP荧光实验。

我们观察到尽管在阻遏中野生型二倍体细胞保留了姐妹染色单体的结合，但是多倍体细胞保持了小的但是明显的结合缺陷（在诺考达唑阻遏中姐妹染色单体分离发生率提高了三倍）显然，在受到诺考达唑影响后，四倍体与二倍体一样有效地表现出停滞现象，并且在实验中一直处于停滞状态。

在被识别的多倍体特异性致死基因的许多单倍体的缺失也被认为是有一个结合缺陷，与那些被发现的野生型的四倍体等级相似。

单倍体突变中姐妹染色单体结合缺陷的原因还不是很清楚，以野生型四倍体有丝分裂的缺陷为基础，我们猜想很可能是相似的机制导致了野生型四倍体以及单倍体突变中结合的缺陷。

四倍体中有丝分裂的缺陷
我们对野生型四倍体有丝分裂的分析表明了它们在染色体分离机制中具有特定的缺陷，
相对于二倍体，多倍体具有较大可能性的染色体缺失，对微管毒物更为敏感，对与纺锤丝作用相关的蛋白质的需求也更多，然而细胞质微小管的动态在单倍体与四倍体中并没有明显的差别，并且只影响细胞质微管作用的基因缺陷被认为是多倍体特异性致死突变，并且，由光漂白后光脱色荧光恢复技术测量的纺锤丝微管的动态在单倍体和多倍体中没有区别。

对三倍体细胞和四倍体细胞处于分裂后期的着丝粒的直接的观察证明，绝大多数着丝粒连接了微管。

与这个观察结果相一致，缺少了纺锤体检查点蛋白Mad1, Mad2或者Mad3的四倍体是可以存活的并且没有可检测的有丝分裂的延迟。

在野生型四倍体群体中，相比之下，我们观察到了对Ipl1蛋白需求的显著的增加，Ipl1蛋白是四倍体菌株中酵母auroraB激酶，能够促进接触的溶解以便促进两极结合并提高检查点的活性（通过无压力的着丝点诱发），并且，四倍体的存活需要Bub1, Bub3以及Sgo1，所有这些蛋白质都牵连在对不正常的着丝点微管压力/接触中，这些结果表明野生型四倍体或者能够增加stntelic接触的数量，引起对Ipl1通道的更高的需要，或者在基本的Ipl1通道功能中产生缺陷。

我们使用不在复制条件下的两中心微型染色体检测了微管-着丝粒的结合。

在DNA复制之后，姐妹染色单体上的着丝粒或者两极分别结合到了微管或者都结合到了一个极点，，前者姐妹染色单体的着丝粒是紧绷的，后者不产生任何张力，很显然，像Ipl1缺陷突变，与单倍体相比野生型四倍体表现出syntelic/单极结合频率的增加，在没有修正的前提下，syntelic 结合导致了染色体不分离，我们通过可见的，跟踪子代细胞中GFP标记的染色体IV的分配测定了染色体不分离的频率，我们发现细胞分裂后期405个中有2个多倍体细胞经历了染色体不分离，但我们在超过1000个处于细胞分裂后期的单倍体细胞中并没有发现不分离现象。

检验分析可见的染色体不分离缺陷的频率与染色体缺失的频率相联系，自然地，在四倍体中染色体缺失的较高的发生率可以很大程度上被染色体不分离所解释，染色体不分离也很可能是syntelic结合的结果。

一些证据支持了观察到的着丝点只结合一极的频率的降低不是由于降低了的Ipll的功能，，Ipll的表达在四倍体中没有减少，不管是在信使RNA或者是蛋白质水平上，此外，我们检测了丝氨酸10在组氨酸H3上的磷酸化作用，H3是活体中激酶活性的标记，这个四倍体细胞中在组氨酸H3上依赖Ipll的丝氨酸10的磷酸化作用是不发生变化的，相比于单倍体来说，这就支持了以下这个结果：自身的四倍体性增加了syntelic/单级接触的频率。

为什么在四倍体细胞中会有syntelic/单极接触的频率的增加呢？因为Ipll的活性似乎是完好的，我们考虑到了缩放限制的可能以及纺锤体几何形状可能的改变，这可能会解释染色体分离缺陷。

尽管细胞体积增大与多倍性有直接的比例关系，但是一些胞内的结构不能被准确测定。

个体的着丝粒，尽管在数量上是加倍的，但是不管在单倍体还是多倍体细胞中都应该是一致的。

并且，我们观察到了细胞分裂后期纺锤丝长度是相同的，不管是在单倍体，二倍体，三倍体还是四倍体细胞中，相比之下，圆盘形状的纺锤丝极体（SPB）以加倍组分数大致加倍表面积以及细胞核微管核化能力的方式结合。

事实上，高分辨率的电子断层成像技术中（相比于单倍体来说），四倍体细胞SPR核表面积大致加倍，这种增加伴随着细胞和微管数目的增加。

因此，在出芽酵母细胞中的多倍体表现出了SPB大小、着丝粒长度与推测的大小、着丝粒的几何形状的不匹配。

我们建议这种改变了的纺锤丝几何形状——我们在二倍体和四倍体酵母细胞发现的最显著的区别——很可能导致四倍体中syntelic接触频率的升高。

比如说，四倍体细胞中SPB 表面积的扩大可能会增加微管对形成syntelic接触的能力。

如果共同起源于SPB细胞核表面的微管对很难形成syntelic接触，因为当着丝点有弯曲的时候它们只是结合了姐妹染色单体，那么情况就是属实的。

其他几何体模型，比如更大的细胞核体积也是可能的。

此外，姐妹染色单体的结合对正常的着丝粒对微管的接触也是必要的，因此结合缺陷也会导致syntelic接触频率的升高以及四倍体细胞中可观测到的染色体的缺失。

我们也注意到出芽酵母细胞或者
动物细胞中细胞周期的时间并没有随染色体倍数的增加而增长，这可能会对其他类型的体积限制产生影响，而这些限制可能会影响DNA损伤的自发修复。

讨论
我们的研究是第一个针对所有生物多倍性的综合的基因分析，我们已经发现了维持基因组的稳定性涉及到的非常小的具体的基因组，这些稳定性对四倍体酵母的生存或者适应是有选择性的需求的。

这个结果提出了一个新的关于多倍性如何影响细胞生理的假设。

我们观测到了四倍体细胞中对同源重组的需求的显著的增加，这个需求似乎不是由于DNA复制和修复整体的缺陷，而用门槛效应是非常容易解释的，而这个门槛效应是由于自发的与DNA复制其他染色体组相关的DNA损伤。

我们关于四倍体的基因分析以及重组改变了的模式表明四倍体在姐妹染色单体结合方面具有缺陷，这个是用实验证明了的。

最后，我们在四倍体细胞中发现了特定的有丝分裂的缺陷，至少可以用有丝分裂纺锤体体积的几何学的限制来作部分解释。

总的来说，这些发现揭示了收缩的基因组和细胞大小能够对基因组稳定性产生深远的影响的机制，这样的机制在各种环境下都会改变基因组的稳定性，从而产生新的多倍体细胞。

我们的发现也涉及到人类与改变多倍性相关联的疾病，最明显的是癌症。

我们最近证实了四倍体能够增进染色体的不稳定和p53-null细胞的肿瘤发生。

四倍体导致染色体的不稳定的机制还不是很清楚，但是细胞分裂失败后额外的中心体被认为起着主要的作用。

同时，在之前的四倍体酵母菌的研究中，四倍体细胞也通过交配产生，因此，它们有更大的SPB（中心粒等价物）。

所以若没有额外的中心体，自身倍数的增加会导致基因组的不稳定。

多倍体特异性死亡现象也可用来描述肿瘤细胞生理学的特征，如果多倍体细胞与非整倍体（经常接近三倍体）的肿瘤细胞具有共同的特征。

我们认为一些原因可以证明情况是属实的。

哺乳动物的CLIP-170，一个多倍体特异性致死基因，在老鼠中不是必须的，但是RNA 干扰揭示了它们在癌细胞系中是必需的。

我们发现四倍体酵母显著地增加了对同源重组所需基因的需求，至少一些肿瘤细胞表现出了对重组修复加强了的需求以及增加了的重组蛋白的水平。

最后auroraB在很多肿瘤细胞中会过多的的表达出来，一些靶向auroraB的药物已经作为化学治疗剂被开发利用，四倍体酵母中对Ipll/auroraB需求的增加可能会提供一个这些药物之所以会成功的基本原理。

因此，由多倍体特异性致死而识别出的生理变化可能成为鉴别新的癌症治疗方法的基础。