ILK在cGVHD狼疮样小鼠肾小管上皮细胞转分化中的作用参考模板

ILK在cGVHD狼疮样小鼠肾小管上皮细胞转
分化中的作用
【摘要】目的观察整合素连接激酶（ILK）在慢性移植物抗宿主病(cGVHD)狼疮样小鼠肾脏中的表达，探讨其在狼疮肾炎肾小管上皮细胞转分化中的作用。

方法建立cGVHD狼疮样小鼠模型，将小鼠分成正常对照组(A组)、12周模型组(B组) 和16周模型组(C组)，每组6只。

采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法、western blot、免疫组织化学法分别检测ILK 、E-钙粘蛋白和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA和蛋白在肾组织中的表达。

结果 RT-PCR和western blot方法分别检测到B、C两组小鼠肾组织ILK、α-SMA mRNA和蛋白表达较A组升高(P均＜0.01)， E-钙粘蛋白表达降低(P均＜0.01)。

ILK蛋白和mRNA表达与α-SMA表达呈正相关（r分别为0.83，0.86，P均＜0.01），与E-钙粘蛋白表达呈负相关（r分别为-0.84，-0.89，P均＜0.01）。

免疫组化结果表明，与A组相比，B、C两组小鼠肾小管及间质均可见ILK、α-SMA蛋白显著表达，而E-钙粘蛋白的表达显著减少。

结论cGVHD狼疮样小鼠肾组织中ILK蛋白及mRNA表达明显上调，可能通过介导肾小管上皮－间充质细胞转分化而参与了狼疮肾炎肾间质纤维化的进程。

【关键词】移植物抗宿主病；狼疮肾炎；粘蛋白类；肾小管；小鼠；动物实验
Abstract: Objective To determine the expression of integrin-linked kinase (ILK) in renal tissue of mice with chronic graft versus host disease (cGVHD) lupus nephritis and its relationship with the epithelial-mesenchymal transition. Methods cGVHD lupus nephritis mice models were conducted. All the mice were divided into three groups: group A (control group, n=6), group B (12-week model group, n=6) and group C (16-week model group, n=6). The mice were killed twelve weeks later (group B) or sixteen weeks later (group C), respectively. The protein and mRNA expressions of ILK, alpha-SMA and E-Cadherin in kidney were detected by using immunohistochemistry, western blot and RT-PCR, respectively. Results The protein and mRNA expression of E-cadherin were significantly down-regulated (P<0.01) in group B and group C compared with group A, while expressions of ILK and alpha-SMA were up-regulated, respectively (P<0.01). The protein and mRNA expressions of ILK were positively correlated with alpha-SMA (r=0.83, and 0.86, all P<0.01), but adversely associated with E-cadherin (r=-0.84, and -0.89, all P<0.01). Conclusion The elevating expression of ILK may play an important role in the process of lupus nephritis through mediating the epithelial-mesenchymal transition.
Key words: graft versus host disease; lupus nephritis; mucins; kidney tubules; mice; animal experimentation
狼疮肾炎（lupus nephritis，LN）是系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus， SLE）最常见临床表现之一，其病理改变具有多样性及不均一性，以肾小球、肾血管、肾间质的损害为主要特征，后期可发展为肾小球硬化、纤维性新月体、间质纤维化及其肾小管萎缩等。

与其他慢性肾脏疾病一样，肾脏纤维化是各型LN 进展到终末期的必经阶段。

肾小管上皮细胞间充质转分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在肾脏纤维化的发生发展中起重要作用，近年来一些研究提示整合素连接激酶（integrin －linked kinase，ILK）可能是介导EMT的关键因子［1］，但是在LN 中EMT的形成以及ILK与EMT关系的研究报道尚少。

我们以慢性移植物抗宿主病（chronic graft versus host disease，cGVHD）狼疮样小鼠为模型，观察不同时期ILK、E-钙粘蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在肾组织中的表达，并探讨ILK在狼疮肾炎肾小管上皮细胞转分化中的作用。

1 材料与方法
1.1 实验动物 8～10周龄（C57BL/6J×DBA/2）F1代杂交雌性小鼠（以下称F1代鼠）及4～6周龄DBA/2雌性小鼠购自中山大学
医学动物中心，体重（19.99
±1.99）g，SPF级。

1.2 模型的建立与分组按随机设计原则将F1代鼠分为正常对照组（A组）、12周模型组（B组）及16周模型组（C组），每组6只小鼠。

建立cGVHD狼疮样小鼠模型。

取DBA/2小鼠脾脏、胸腺、淋巴结细胞，制成单细胞悬液（约60%脾细胞、30%胸腺细胞及10%淋巴结细胞）。

分别于第0、3、7、10天注射于模型组F1代鼠，每次注射给予细胞数约为50×106个。

正常对照组于相同时间点经尾静脉注射与单细胞悬液等体积的生理盐水。

于首次注射单细胞悬液之日起，于第12周末处死B组小鼠，于第16周末处死A组和C组小鼠。

处死后立即取下肾脏，将肾包膜完全剥离后，一部分保存于-80℃以备提取总RNA和蛋白质，另一部分固定于10%中性福尔马林溶液中，经石蜡包埋后切片进行组织病理检查及免疫组织化学实验。

1.3 组织病理切片 2μm连续切片，至经多聚赖氨酸包被的载玻片上，二甲苯脱蜡，梯度酒精至水，分别行苏木素－伊红（hematoxylin－eosin，HE）染色和Masson染色。

1.4 免疫组织化学 SP法进行免疫组化染色。

将肾组织石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，3%过氧化氢室温孵育10min灭活内源性过氧化物酶，微波修复抗原，10%正常羊血清封闭，37℃孵育15min，分别滴加兔抗小鼠ILK抗体（1∶50，Upstate公司）、兔抗小
鼠E-钙粘蛋白抗体（1
∶100，Sigma公司）、兔抗小鼠α-SMA抗体（1∶100，Santecruz 公司）4℃孵育过夜，再依次加入生物素偶联的羊抗兔IgG抗体和辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素，各37℃孵育15min 二氨基联苯胺(DAB)染色，显微镜下控制显色，HE复染，常规脱水、透明、封片镜检。

磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。

1.5 western blot 取－80℃保存的肾组织50～80mg，加适量裂解液后匀浆，冰中静置30min，离心，取上清，测蛋白浓度，加蛋白上样缓冲液，煮沸4min，瞬时高速离心，十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移蛋白至PVDF膜上，丽春红染色观察转膜情况，TBST洗膜，5％BSA封闭，分别加入兔抗小鼠ILK抗体，兔抗小鼠E-钙粘蛋白抗体、兔抗小鼠α-SMA抗体、兔抗小鼠，室温孵育1.5h，TBST 洗膜，化学发光显示结果。

图片扫描保存后用Totallab
2.01分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化。

以GAPDH为内参，用目的蛋白条带灰度值与内参灰度值的比值代表目的蛋白的相对表达含量。

1.6 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)
1.6.1 总RNA的提取将肾组织从-80℃冰箱中取出，迅速用Trizol（Invitrogen公司）匀浆后提取总RNA。

取5μl总RNA进行甲醛变性凝胶电泳，紫外灯下观察5、18、28s条带清晰提示完整无降解。

1.6.2 逆转录体系在PCR管中加入10×逆转录缓冲液1μl，MgCl2(25mmol/L)2μl，Oligo dNTPs(10 mmol/L)2μl，RNA酶抑制剂0.25μl，AMV逆转录酶（TAKARA公司）1μl，总RNA275μl，30℃，10min后，42℃逆转录50min，99℃灭活逆转录酶5min，5℃，5min，所得的cDNA保存于-20℃，用于PCR扩增。

1.6.3 PCR扩增 ILK、α-SMA、E-钙粘蛋白及GAPDH内参照引物由DNA club软件设计，由Invitrogen公司合成，序列见表１。

表１引物序列（略）
PCR反应体系5×PCR缓冲液10μl，MgCl2(25mmol/L) 4μl，dNTPs(10 mmol/L)1μl，上下游引物各1μl（（10μmol/L），cDNA模版1μl，TaqDNA聚合酶（5U/μl ）(TAKARA公司)0.25μl，补足双蒸水至50μl。

97℃预变性后，94℃变性30s，59℃退火50s，72℃延伸1min为一个循环，共38个循环后，72℃终末延伸7min。

1.6.4 产物检测取PCR扩增产物5μl，于含有5μg/ml溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶中进行电泳，45min。

于Image Master VDS凝胶扫描仪上成像，用Totallab
2.01凝胶图像分析软件进行半定量分析。

所有ILK、E-钙粘蛋白和
α-SMA扩增产物的吸光度均以GAPDH为基准较正，分别用ILK/GAPDH、E-钙粘蛋白/GAPDH和α-SMA/GAPDH表示。

1.7 统计学处理计量资料采用±s表示，使用SPSS 13.0统计软件，两组间比较采用ｔ检验，两变量间相关性采用直线相关分析。

2 结果
2.1 肾脏病理改变模型组肾小球系膜区增宽，基质大量增生；小管多灶性萎缩，管腔内可见蛋白管型及细胞管型，B组间质大量单个核细胞浸润并有基质沉积，C组细胞数减少并出现部分肾小管空泡化。

Masson染色可见C组小鼠肾小球囊壁，肾小管间质有明显的胶原纤维沉积，B组胶原纤维较C型组少，主要位于肾小管间质。

A 组肾组织未见明显胶原沉积。

2.2 免疫组织化学检测结果见图１。

ILK在A组肾小球及肾小管上皮细胞中无明显表达，在B组小鼠肾组织小管及间质中表达增强，而在C组小鼠肾组织中表达较B组进一步增加。

E-钙粘蛋白几乎表达于A组所有上皮细胞中，而在B组、C组小鼠随着肾小管上皮细胞结构的破坏，表达减弱。

A组
α-SMA仅表达于血管平滑肌细胞和间质少量成纤维细胞，B组小鼠肾小管上皮细胞和间质α-SMA的表达开始升高，C组小鼠肾小管上皮细胞和间质中α-SMA阳性细胞数明显增加。

A图 A组肾小球及肾小管上皮细胞中无明显表达；（略）
B图 B组小鼠肾组织小管及间质中表达增强；（略）
C图 C组小鼠肾组织中表达较B组进一步增加（略）
图１ ILK免疫组织化学检测结果（SP法400倍放大）（略）
2.3 western blot蛋白定量测定结果见表２。

与A组比，B、C两组ILK、α-SMA蛋白含量显著增加E-钙粘蛋白蛋白含量显著减少（P均＜0.01)；C组与B组相比E-钙粘蛋白的蛋白含量下降，ILK、α-SMA蛋白含量增加(P均＜0.01)。

ILK与E-钙粘蛋白的蛋白表达呈负相关（r＝-0.84，P＜0.01)，与α-SMA蛋白的表达呈正相关（r＝0.83，P＜0.01)。

表２各组小鼠western blot蛋白定量测定结果（略）
与A组相比，a：t＝25.78，b：t＝14.91，c：t＝24.12，d：t＝26.13，e：t＝10.12，f：t＝62.17，P均＜0.01；与B组相比，g：t＝6.54，h：t＝10.08，i：t＝4.17，P均＜0.01
2.4 RT-PCR检测结果见表３。

与A组相比，B组、C组ILK、α-SMA mRNA含量显著增加（P均＜0.01)， E-钙粘蛋白 mRNA含量显著减少（P均＜0.01)；C组与B组相比E-钙粘蛋白mRNA含量下降，ILK、α-SMA mRNA含量增加（P均＜0.01)。

ILK与E-钙粘蛋白mRNA 表达呈负相关（r＝-0.89，P＜0.01)，与α-SMA mRNA的表达呈正相关（r＝0.86，P＜0.01)。

表３各组小鼠mRNA检测结果（略）
与A组相比，a：t＝16.84，b：t＝23.03，c：t＝14.12，d：t＝28.24，e：t＝28.24，f：t＝41.21，P均＜0.01；与B组相比，g：t＝14.49，h：t＝10.01，i：t＝15.22，P均＜0.01
3 讨论
cGVHD狼疮样肾炎小鼠模型，是国际公认并被广泛应用的LN 小鼠模型，在不同时期有不同病理特点：首次淋巴细胞注射后12周时
以肾小球系膜增宽、基底膜节段性增厚、肾间质细胞浸润为特点，至16周则以肾小球基质大量增生、细胞明显减少、肾间质纤维化为主要特征。

肾间质纤维化是各型LN发展到终末期的共同表现，近年来研究发现［2］，阻断EMT过程可以减轻肾脏纤维化程度。

E－钙粘蛋白是上皮细胞表型的标志性蛋白，也是上皮细胞间重要的粘附分子，在维持上皮细胞极性和功能方面起重要的作用［3］。

肌成纤维细胞（ｍyofibroblast，MFB）是间充质的主要组成细胞之一，α-SMA是MFB表型的标志性蛋白，许多其他肾脏固有细胞，如肾小管上皮细胞和系膜细胞在病理状态下可发生表型转变，从表达低水平α-SMA转化成表达高水平α-SMA的MFB，而高水平α-SMA的表达增强了细胞迁移、侵袭和游走的能力。

我们的实验结果显示：E－钙粘蛋白在12周模型组小鼠肾小管上皮细胞中表达降低，在16周模型组表达进一步下降，而α-SMA的表达情况则与E－钙粘蛋白相反，提示cGVHD 狼疮样小鼠肾小管上皮细胞存在着EMT的过程。

ILK可以通过其C末端的激酶催化结构域与整合素β1和β3的胞内区相连，参与整合素介导细胞与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）及细胞间的粘附，以及细胞的识别、生长和分化过程等病理生理过程。

C末端的激酶催化结构域中一些细胞骨架蛋白的结合位点，参与EMT中细胞肌动蛋白的重组，在细胞骨架改变中起作用［4］。

通过免疫双染色的方法发现ILK在正常的肾小球上皮细胞，系膜细胞和内皮细胞中有弱表达，在糖尿病肾病、系膜增生性肾小球肾炎、UUO 模型肾组织中表达显著增加［5］。

公认致纤维化的转化生长因子-β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）在病理情况下能诱导并维持EMT的发生，而且主要通过EMT来发挥其致纤维化的作用。

我们以往的研究结果［6］显示在LN肾组织中TGF-β1的表达显著增高。

近年来，Li等［1］提出了TGF-β主要通过Smad途径诱导EMT的发生，并且是通过Smad信号途径诱导肾小管上皮细胞ILK的表达。

过度表达的ILK能诱导EMT4个关键步骤的发生。

首先，它能使上皮细胞E-钙粘蛋白丢失，并伴随着α-SMA的表达。

ILK能激活淋巴细胞增强子结合因子－1/β－连环蛋白（LEF-1/β－catenin）复合物的转录因子。

当ILK与LEF－1结合后，LEF－1被激活能够促进Snail基因的表达［7］。

Snail能够与E－钙粘蛋白的启动子区E-box直接结合，从而抑制E－钙粘蛋白基因的表达，使E－钙粘蛋白表达下降、间质细胞基因表达上调，引起细胞－细胞间粘附的丧失、细胞－ECM相互作用的减弱［8］。

另外ILK 激活的PI3K/AKT/Rac1能促进肌动蛋白重排，与此同时β－catenin 的活化与核聚集促进了α-SMA的表达。

其次，过度表达的ILK能导致纤维连接蛋白（fibronectin，FN）的表达和FN在细胞外的聚积。

FN 是损伤后分泌增加的ECM的主要成分之一，在肾间质中的ECM主要由肌成纤维细胞分泌，而肾小管上皮细胞的转分化是肌成纤维细胞的主要来源之一。

再次，ILK的过度表达能通过激活AP-1等机制，引起MMP-２、９的表达和分泌增多，破坏基底膜的完整性，并通过钙依赖方式直接磷酸化肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）增加细胞的迁
移和浸润能力，使上皮细胞通过基底膜向间质游走。

早期阻断和逆转肾间质纤维化对LN向终末期肾竭进展具有重大意义，本试验通过cGVHD狼疮样小鼠模型的构建，分别以E－钙粘蛋白、α-SMA为上皮细胞和间充质细胞的检测指标从mRNA及蛋白水平证实了在LN肾小管上皮细胞EMT过程的存在，并且发现ILK的表达与α-SMA的表达呈正相关，与E-钙粘蛋白表达呈负相关，提示ILK 可能参与了LN肾小管上皮细胞EMT过程，抑制ILK的表达与功能可能成为延缓LN肾脏纤维化进展的一个新治疗靶点，为LN的治疗提供新途径。

【参考文献】
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