第七章 细胞重组与细胞融合ppt课件

1、速度沉降主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种沉 降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒 的最小密度。生物颗粒（细胞或细胞器）在十分平缓的密度梯度介质中 按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。 2、等密度沉降适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的 介质中经足够大离心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的 介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。 介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度，而且介质的梯度要求较 高的陡度，不能太平缓。这种方法适于分离细胞器，而不太适于分离和 纯化细胞。
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速度沉降
等密度沉降
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三、细胞器转移
• 细胞器转移是将一个物种的细胞器转移到另一个物种细胞 中的技术。
• 细胞器转移类似细胞核移植技术。不同的是操作对象为细 胞器，不是细胞核。
• 最常见的是线粒体和叶绿体的细胞器转移。 • 细胞器转移方法有微注射、载体转移、胞吞胞饮等方式。
有质膜的细胞核，也成为小型细胞。核体能够重 生其胞质部分，继续生长分裂。 胞质体：除去细胞核后由质膜包裹的无核细胞。 细胞松弛素B处理细胞能诱发细胞排核反应，此时 通过离心的方法整
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• 微细胞 微细胞：又称微核体，含有一条或几条染色体，外
有一薄层细胞质和一个完整质膜的核质体。
• 生物酶解法 利用溶解细胞壁的酶处理细胞，破坏细胞壁，使细胞内含 组分释放。
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二、细胞器及细胞组分分离
• 细胞内不同组份的密度和大小都不相同，在同一离心场内 的沉降速度也不同，因此，常用不同转速的离心法将细胞 内各种组份分级分离出来。
• 细胞器及细胞组份分离过程包括组织细胞匀浆、分级分离 和分析三步。细胞匀浆要在低温条件、等渗缓冲液（等渗 匀浆介质，如0.25mol/L的蔗糖）中进行。
• 差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。 对于精细的分离，则是密度梯度离心效果更好。
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• 密度梯度离心：用一定的介质在离心管内形成一连续或不 连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部， 通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。
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密度梯度离心又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种
• 细胞质工程涉及的技术有：
1、细胞破碎
2、细胞器及细胞组分分离
3、细胞器转移
4、胞质杂种
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一、细胞破碎
• 细胞破碎是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容 物释放出来的技术。
• 细胞破碎方法包含： 1、超声波破碎法 2、反复冻融法 3、高速组织捣碎法 4、化学裂解法 5、生物酶解法
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• 差速离心：在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心， 用于分离不同大小的细胞和细胞器。
速度逐渐提高，样品按大小先后沉降
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• 在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：细胞核、线粒体、溶酶体与 过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。
• 由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常 被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复2～3次效果会好一些。
秋水仙素和长春新碱等有丝分离阻断剂能干扰微管的合成与 装配，导致细胞分裂后期染色体产生发散运动，发散开的 染色体各自装配出自己的核膜，形成微细胞。
秋水仙胺
细胞松弛素B
细胞松弛素B
离心
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细胞重组的方式
• 胞质体与完整细胞的重组形成胞质杂种； • 微细胞与完整细胞的重组形成微细胞核异体； • 胞质体与核体重新组合形成重组细胞。
第七章 细胞重组与细胞融合
生物科学与技术学院
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细胞重组与细胞融合
• 细胞重组：从活细胞中分离出细胞器及其组份， 在体外进行重新装配成为具有生物活性的细胞的 一种技术。
• 细胞融合：人工方法使2个或2个以上的细胞合并 形成1个细胞的技术。
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• 核体与胞质体 核体：与细胞质分离后得到的带有少量细胞质并包
• 细胞器及细胞组份分离方法包含：
1、差速离心法
2、密度梯度分离法
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• 沉降系数：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。沉降 系数是以时间表示的。
• 蛋白质，核酸等生物大分子的S实际上时常在10的-13次方 秒左右，故把沉降系数10的-13次方秒称为一个Svedberg 单位，简写S，即10的-13方秒=1S。
• 大多数蛋白质和核酸的沉降系数在4S和40S之间，核糖体 及其亚基在30S和80S之间，多核糖体在100S以上。
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离心方式
• 离心运动是指物体有远离中心运动的现象。 • 根据离心机的类型分为水平离心、角离心（偏水平）和垂直离心三种。
• 根据离心方式分为差速离心和密度梯度离心两种。
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细胞重组的意义
• 细胞重组技术将细胞融合技术与细胞核质分离技 术相结合，为重新构建不同类型的杂种细胞提供 可能；
• 细胞重组技术可以人为的将染色体或者基因进行 转移，使重组细胞产生新的性状和新的特性。
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细胞质工程
• 细胞质工程：是研究真核细胞的核-质关系以及细 胞器、细胞质基因转移的技术。细胞质工程是进 行细胞重组的重要基础。
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四、胞质杂种
• 概念一：将两种不同来源的核外遗传物质（线粒体和叶绿 体）与一个特定的细胞核组合在一起得到的细胞称为胞质 杂种。
• 概念二：来自两个原生质体融合产生的细胞，其中一个细 胞的细胞核消失后，两个亲代原生质的细胞质杂交得到的 个体成为胞质杂种。
• 核心概念是细胞质的杂交，不是细胞核，其中细胞质中存 在不同来源的细胞器，尤其是线粒体和叶绿体。
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• 超声波破碎法 利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞 悬浮液，由发生器和换能器组成。
• 反复冻融法 将细胞放在低温下冷冻，然后在室温中融化，反复多次而 达到破壁作用。
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• 高速组织捣碎法 借助高速组织捣碎机使细胞被高速旋转的叶片打碎。
• 化学裂解法 通过化学药品改变细胞膜的通透性，使其裂解。