一种L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基及发酵培养L-天冬氨酸酶基

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811074978.7
(22)申请日 2018.09.14
(71)申请人 宿州学院
地址 234000 安徽省宿州市教育园区宿州
学院东区
(72)发明人 徐礼生　张兴桃　陈红玲　高贵珍　
赵亮　曹稳根　苏博　
(74)专利代理机构 合肥市浩智运专利代理事务
所(普通合伙) 34124
代理人 王亚洲
(51)Int.Cl.
C12N 9/88(2006.01)
C12N 1/00(2006.01)
(54)发明名称
一种L -天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基
及发酵培养L -天冬氨酸酶基因工程菌方法
(57)摘要
本发明公开了一种L -天冬氨酸酶基因工程
菌发酵培养基及发酵培养L -天冬氨酸酶基因工
程菌方法，其中，培养基包括以下质量浓度的组
分：酵母粉2-10g/L、蛋白胨5-20g/L、乳糖1-10g/
L、氯化钠1-10g/L、黄豆饼粉1-15g/L、玉米浆1-
5g/L、籼米粉0.5-5g/L、钼酸铵0.5-2g/L、钴盐
0.5-10mg/L、通过本发明公开的技术方案培养L -
天冬氨酸酶基因工程菌，不仅菌细胞密度大，且
L -天冬氨酸酶基因工程菌增殖快速，细胞浓度较
高。

权利要求书1页 说明书5页CN 109207463 A 2019.01.15
C N 109207463
A
1.一种L -天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基，其特征在于，所述L -天冬氨酸酶基因工程菌培养基包括以下质量浓度的组分：酵母粉2-10g/L、蛋白胨5-20g/L、乳糖1-10g/L、氯化钠1-10g/L、黄豆饼粉1-15g/L、玉米浆1-5g/L、籼米粉0.5-5g/L、钼酸铵0.5-2g/L、钴盐0.5-10mg/L。

2.根据权利要求1所述的L -天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基，其特征在于，所述钴盐为硝酸钴。

3.根据权利要求2所述的L -天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基，其特征在于，所述L -天冬氨酸酶基因工程菌培养基包括以下质量浓度的组分：酵母粉2-5g/L、蛋白胨5-10g/L、乳糖1-5g/L、氯化钠1-5g/L、黄豆饼粉1-10g/L、玉米浆1-5g/L、籼米粉1-5g/L、钼酸铵0.5-1g/L、硝酸钴0.5-5mg/L。

4.根据权利要求3所述的L -天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基，其特征在于，所述L -天冬氨酸酶基因工程菌培养基包括以下质量浓度的组分：酵母粉4g/L、蛋白胨7g/L、乳糖3g/L、氯化钠4g/L、黄豆饼粉5g/L、玉米浆4g/L、籼米粉2g/L、钼酸铵0.7g/L、硝酸钴1.5mg/L。

5.根据权利要求3所述的L -天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基，其特征在于，所述L -天冬氨酸酶基因工程菌培养基包括以下质量浓度的组分：酵母粉2.5g/L、蛋白胨
6.5g/L、乳糖
3.5g/L、氯化钠2.5g/L、黄豆饼粉7.5g/L、玉米浆2.5g/L、籼米粉3.5g/L、钼酸铵0.8g/L、硝酸钴1.5mg/L。

6.根据权利要求1-5任一所述的L -天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基，其特征在于，所述L -天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基的制备方法如下：按照重量组份配比，将酵母粉、蛋白胨、黄豆饼粉和籼米粉混匀后，加入乳糖、氯化钠、钼酸铵和硝酸钴，加水搅拌均匀，灭菌后，即得。

7.一种采用权利要求1-6任一项所述的L -天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基发酵培养L -天冬氨酸酶基因工程菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、按照L -天冬氨酸酶基因工程菌的常规培养方法将L -天冬氨酸酶基因工程菌培养至对数期；
S2、将对数期的L -天冬氨酸酶基因工程菌接种到L -天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基中，控制发酵温度为25-37℃，调节培养基内培养液的pH为7.2-7.6，发酵培养8-14h后，即得。

8.根据权利要求7所述的发酵培养L -天冬氨酸酶基因工程菌的方法，其特征在于，所述步骤S2中控制发酵温度为30℃，调节培养基内培养液的pH为7.5，发酵培养10h后，即得。

9.根据权利要求7所述的发酵培养L -天冬氨酸酶基因工程菌的方法，其特征在于，所述步骤S2中控制发酵温度为32℃，调节培养基内培养液的pH为7.5，发酵培养8h后，即得。

10.根据权利要求7所述的发酵培养L -天冬氨酸酶基因工程菌的方法，其特征在于，所述步骤S2中控制发酵温度为35℃，调节培养基内培养液的pH为7.3，发酵培养12h后，即得。

权　利　要　求　书1/1页CN 109207463 A
一种L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基及发酵培养L-天冬
氨酸酶基因工程菌方法
技术领域
[0001]本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及的是一种L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基及发酵培养L-天冬氨酸酶基因工程菌方法。

背景技术
[0002]发酵工程是指采用工程技术手段，利用生物(主要是微生物)和有活性的离体酶的某些功能，为人类生产有用的生物产品，或直接用微生物参与控制某些工业生产过程的一种技术。

人们熟知的利用酵母菌发酵制造啤酒、果酒、工业酒精，乳酸菌发酵制造奶酪和酸牛奶，利用真菌大规模生产青霉素等都是这方面的例子。

随着科学技术的进步，发酵技术也有了很大的发展，并且已经进入能够人为控制和改造微生物，使这些微生物为人类生产产品的现代发酵工程阶段。

现代发酵工程作为现代生物技术的一个重要组成部分，具有广阔的应用前景。

例如，用基因工程的方法有目的地改造原有的菌种并且提高其产量；利用微生物发酵生产药品，如人的胰岛素、干扰素和生长激素等。

[0003]基于发酵工程的显著工业化生产优势，一系列通过发酵工程技术，发酵生产特定的有益菌、药物、细菌代谢物，得到广泛应用，如L-天冬氨酸基因工程菌的培养。

[0004]L-天冬氨酸酶基因工程菌的菌体内含有大量的L-天冬氨酸酶(EC 4.3.1.1)，而L-天冬氨酸酶是一种重要的工业用酶，该酶广泛存在于细菌、酵母和植物体中，该酶由4个相同亚基组成，催化氨和富马酸发生加成反应得到天冬氨酸。

[0005]因此，改进L-天冬氨酸酶基因工程菌的发酵培养技术，对于提高生产L-天冬氨酸酶活性，提高L-天冬氨酸工业化生产意义重大。

[0006]然而，目前L-天冬氨酸酶基因工程菌规模化培养存在的主要问题是生长较为缓慢，酶的活性不高，而合适的培养基能极大地促进L-天冬氨酸酶基因工程菌的生长，增加细胞密度，同时提高酶的活性。

发明内容
[0007]本发明所要解决的技术问题在于如何解决目前L-天冬氨酸酶基因工程菌规模化培养生长较为缓慢，酶的活性不高的问题。

[0008]本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
[0009]一种L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基，所述L-天冬氨酸酶基因工程菌培养基包括以下质量浓度的组分：酵母粉2-10g/L、蛋白胨5-20g/L、乳糖1-10g/L、氯化钠1-10g/L、黄豆饼粉1-15g/L、玉米浆1-5g/L、籼米粉0.5-5g/L、钼酸铵0.5-2g/L、钴盐0.5-10mg/L。

[0010]优选地，所述L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基，所述钴盐为硝酸钴。

[0011]优选地，所述L-天冬氨酸酶基因工程菌培养基包括以下质量浓度的组分：酵母粉2-5g/L、蛋白胨5-10g/L、乳糖1-5g/L、氯化钠1-5g/L、黄豆饼粉1-10g/L、玉米浆1-5g/L、籼米粉1-5g/L、钼酸铵0.5-1g/L、硝酸钴0.5-5mg/L。

[0012]优选地，所述L-天冬氨酸酶基因工程菌培养基包括以下质量浓度的组分：酵母粉4g/L、蛋白胨7g/L、乳糖3g/L、氯化钠4g/L、黄豆饼粉5g/L、玉米浆4g/L、籼米粉2g/L、钼酸铵0.7g/L、硝酸钴1.5mg/L。

[0013]优选地，所述L-天冬氨酸酶基因工程菌培养基包括以下质量浓度的组分：酵母粉2.5g/L、蛋白胨6.5g/L、乳糖3.5g/L、氯化钠2.5g/L、黄豆饼粉7.5g/L、玉米浆2.5g/L、籼米粉3.5g/L、钼酸铵0.8g/L、硝酸钴1.5mg/L。

[0014]上述L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基的制备方法如下：按照重量组份配比，将酵母粉、蛋白胨、黄豆饼粉和籼米粉混匀后，加入乳糖、氯化钠、钼酸铵和硝酸钴，加水搅拌均匀，灭菌后，即得。

[0015]同时，本发明公开一种以上述L-天冬氨酸酶基因工程菌培养基为培养基，发酵培养L-天冬氨酸酶基因工程菌的方法，具体包括以下步骤：
[0016]S1、按照L-天冬氨酸酶基因工程菌的常规培养方法将L-天冬氨酸酶基因工程菌培养至对数期；
[0017]S2、将对数期的L-天冬氨酸酶基因工程菌接种到L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基中，控制发酵温度为25-37℃，调节培养基内培养液的pH为7.2-7.6，发酵培养8-14h后，即得。

[0018]优选地，所述步骤S2中控制发酵温度为30℃，调节培养基内培养液的pH为7.5，发酵培养10h后，即得。

[0019]优选地，所述步骤S2中控制发酵温度为32℃，调节培养基内培养液的pH为7.5，发酵培养8h后，即得。

[0020]优选地，所述步骤S2中控制发酵温度为35℃，调节培养基内培养液的pH为7.3，发酵培养12h后，即得。

[0021]本发明相比现有技术具有以下优点：
[0022]1、培养基组分配方配伍合理，采用上述培养基培养L-天冬氨酸酶基因工程菌，不仅菌细胞密度大，且L-天冬氨酸酶基因工程菌增殖快速，细胞浓度较高。

[0023]2、培养基组分中的硝酸钴能够明显促进L-天冬氨酸酶基因工程菌的增殖，能够促进L-天冬氨酸酶基因工程菌催化合成L-天冬氨酸，相对于现有技术公开的其他盐如镁盐、钙盐，硝酸钴对L-天冬氨酸酶基因工程菌的代谢影响更加显著。

具体实施方式
[0024]下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

[0025]实施例1
[0026]一种L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基，所述L-天冬氨酸酶基因工程菌培养基包括以下质量浓度的组分：酵母粉2g/L、蛋白胨5g/L、乳糖1g/L、氯化钠1g/L、黄豆饼粉1g/ L、玉米浆5g/L、籼米粉0.5g/L、钼酸铵0.5g/L、硝酸钴0.5mg/L。

[0027]上述L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基的制备方法如下：
[0028]按照重量组份配比，将酵母粉、蛋白胨、黄豆饼粉和籼米粉混匀后，加入乳糖、氯化
菌的方法包括以下步骤：
[0030]S1、按照L-天冬氨酸酶基因工程菌的常规培养方法将L-天冬氨酸酶基因工程菌培养至对数期；
[0031]S2、将对数期的L-天冬氨酸酶基因工程菌接种到L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基中，控制发酵温度为30℃，调节培养基内培养液的pH为7.5，发酵培养10h后，即得。

[0032]实施例2
[0033]一种L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基，所述L-天冬氨酸酶基因工程菌培养基包括以下质量浓度的组分：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、乳糖10g/L、氯化钠10g/L、黄豆饼粉15g/L、玉米浆5g/L、籼米粉5g/L、钼酸铵2g/L、硝酸钴10mg/L。

[0034]上述L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基的制备方法如下：
[0035]按照重量组份配比，将酵母粉、蛋白胨、黄豆饼粉和籼米粉混匀后，加入乳糖、氯化钠、钼酸铵和硝酸钴，加水搅拌均匀，灭菌后，即得。

[0036]采用上述L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基，发酵培养L-天冬氨酸酶基因工程菌的方法包括以下步骤：
[0037]S1、按照L-天冬氨酸酶基因工程菌的常规培养方法将L-天冬氨酸酶基因工程菌培养至对数期；
[0038]S2、将对数期的L-天冬氨酸酶基因工程菌接种到L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基中，控制发酵温度为30℃，调节培养基内培养液的pH为7.5，发酵培养12h后，即得。

[0039]实施例3
[0040]一种L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基，所述L-天冬氨酸酶基因工程菌培养基包括以下质量浓度的组分：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、乳糖5g/L、氯化钠5g/L、黄豆饼粉10g/L、玉米浆5g/L、籼米粉5g/L、钼酸铵1g/L、硝酸钴5mg/L。

[0041]上述L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基的制备方法如下：
[0042]按照重量组份配比，将酵母粉、蛋白胨、黄豆饼粉和籼米粉混匀后，加入乳糖、氯化钠、钼酸铵和硝酸钴，加水搅拌均匀，灭菌后，即得。

[0043]采用上述L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基，发酵培养L-天冬氨酸酶基因工程菌的方法包括以下步骤：
[0044]S1、按照L-天冬氨酸酶基因工程菌的常规培养方法将L-天冬氨酸酶基因工程菌培养至对数期；
[0045]S2、将对数期的L-天冬氨酸酶基因工程菌接种到L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基中，控制发酵温度为25℃，调节培养基内培养液的pH为7.6，发酵培养14h后，即得。

[0046]实施例4
[0047]一种L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基，所述L-天冬氨酸酶基因工程菌培养基包括以下质量浓度的组分：酵母粉2g/L、蛋白胨5g/L、乳糖5g/L、氯化钠2g/L、黄豆饼粉5g/ L、玉米浆2g/L、籼米粉0.5g/L、钼酸铵0.5g/L、硝酸钴0.5mg/L。

[0048]上述L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基的制备方法如下：
[0049]按照重量组份配比，将酵母粉、蛋白胨、黄豆饼粉和籼米粉混匀后，加入乳糖、氯化
菌的方法包括以下步骤：
[0051]S1、按照L-天冬氨酸酶基因工程菌的常规培养方法将L-天冬氨酸酶基因工程菌培养至对数期；
[0052]S2、将对数期的L-天冬氨酸酶基因工程菌接种到L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基中，控制发酵温度为37℃，调节培养基内培养液的pH为7.2，发酵培养8h后，即得。

[0053]实施例5
[0054]一种L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基，所述L-天冬氨酸酶基因工程菌培养基包括以下质量浓度的组分：酵母粉2g/L、蛋白胨5g/L、乳糖1g/L、氯化钠5g/L、黄豆饼粉10g/ L、玉米浆5g/L、籼米粉1g/L、钼酸铵0.5g/L、硝酸钴5mg/L。

[0055]上述L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基的制备方法如下：
[0056]按照重量组份配比，将酵母粉、蛋白胨、黄豆饼粉和籼米粉混匀后，加入乳糖、氯化钠、钼酸铵和硝酸钴，加水搅拌均匀，灭菌后，即得。

[0057]采用上述L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基，发酵培养L-天冬氨酸酶基因工程菌的方法包括以下步骤：
[0058]S1、按照L-天冬氨酸酶基因工程菌的常规培养方法将L-天冬氨酸酶基因工程菌培养至对数期；
[0059]S2、将对数期的L-天冬氨酸酶基因工程菌接种到L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基中，控制发酵温度为32℃，调节培养基内培养液的pH为7.2-7.6，发酵培养9h后，即得。

[0060]实施例6
[0061]一种L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基，所述L-天冬氨酸酶基因工程菌培养基包括以下质量浓度的组分：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、乳糖5g/L、氯化钠1g/L、黄豆饼粉1g/ L、玉米浆1g/L、籼米粉5g/L、钼酸铵1g/L、硝酸钴0.5mg/L。

[0062]上述L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基的制备方法如下：
[0063]按照重量组份配比，将酵母粉、蛋白胨、黄豆饼粉和籼米粉混匀后，加入乳糖、氯化钠、钼酸铵和硝酸钴，加水搅拌均匀，灭菌后，即得。

[0064]采用上述L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基，发酵培养L-天冬氨酸酶基因工程菌的方法包括以下步骤：
[0065]S1、按照L-天冬氨酸酶基因工程菌的常规培养方法将L-天冬氨酸酶基因工程菌培养至对数期；
[0066]S2、将对数期的L-天冬氨酸酶基因工程菌接种到L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基中，控制发酵温度为32℃，调节培养基内培养液的pH为7.5，发酵培养8h后，即得。

[0067]实施例7
[0068]一种L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基，所述L-天冬氨酸酶基因工程菌培养基包括以下质量浓度的组分：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、乳糖5g/L、氯化钠1g/L、黄豆饼粉1g/ L、玉米浆1g/L、籼米粉5g/L、钼酸铵1g/L、硝酸钴0.5mg/L。

[0069]上述L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基的制备方法如下：
[0070]按照重量组份配比，将酵母粉、蛋白胨、黄豆饼粉和籼米粉混匀后，加入乳糖、氯化
菌的方法包括以下步骤：
[0072]S1、按照L-天冬氨酸酶基因工程菌的常规培养方法将L-天冬氨酸酶基因工程菌培养至对数期；
[0073]S2、将对数期的L-天冬氨酸酶基因工程菌接种到L-天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基中，控制发酵温度为35℃，调节培养基内培养液的pH为7.3，发酵培养12h后，即得。

[0074]发酵培养试验：
[0075]为了验证采用上述实施例发酵培养L-天冬氨酸酶基因工程菌的效果，进行以下发酵试验：
[0076]试验方法：试验分为实验组、第一对照组和第二对照组，其中，实验组按照实施例1-6公开的培养基和发酵方法，进行发酵培养L-天冬氨酸酶基因工程菌。

发酵完毕，称取L-天冬氨酸酶基因工程菌的平均湿重。

[0077]第一对照组采用LB培养基，培养发酵L-天冬氨酸酶基因工程菌，发酵方法与实施例1相同，第二对照组与实验组的区别是:第二对照组使用的培养基中不添加有硝酸钴。

试验结果如表1所示：
[0078]表1
[0079]
试验/组别平均菌湿重/g/L
实施例128.9
实施例228.2
实施例328.6
实施例431.3
实施例528.4
实施例629.1
第一对照组11.2
第二对照组20.9
[0080]由表1公开的数据可知：本发明公开的培养基配方，用于L-天冬氨酸酶基因工程菌的发酵培养中，L-天冬氨酸酶基因工程菌增殖更为显著，且组分中的硝酸钴能够明显提高L-天冬氨酸酶基因工程菌的增殖。

[0081]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。