博尔纳病病毒接种Wistar大鼠脑组织中病毒基因组的原位检测

博尔纳病病毒接种Wistar大鼠脑组织中病毒基因组的原位检
测
刘爱平;李玉军;李小光;宋武琦;李爱梅;周淑如;张凤民
【摘要】本文旨在用原位杂交法探讨博尔纳病病毒(BDV)接种Wistar大鼠脑组织中BDV基因组的分布情况.DIG RNA labeling kit标记BDV p24正链探针后,用斑点实验检测该探针的标记效率,斑点杂交法检测该探针的特异性.在其标记效率与特异性均达到实验要求后,用该探针对颅内接种BDV(H1766株)的Wistar大鼠脑组织中BDV基因组进行原位杂交检测.结果发现,接种3周后,BDV感染主要发生在皮质和海马,仅少量发生在丘脑和下丘脑;接种6周后,皮质和海马的BDV感染仍然存在,且丘脑和下丘脑的BDV感染明显增强,说明BDV在大鼠脑组织中的分布范围随着感染时间的延长而逐步扩大.本文建立的原位杂交法可用于检测BDV在Wistar 大鼠脑组织内的分布与迁移情况.
【期刊名称】《微生物与感染》
【年(卷),期】2009(004)003
【总页数】4页(P152-155)
【关键词】博尔纳病病毒;大鼠;原位杂交;斑点杂交
【作者】刘爱平;李玉军;李小光;宋武琦;李爱梅;周淑如;张凤民
【作者单位】哈尔滨医科大学微生物学教研室、黑龙江省感染与免疫重点实验室,哈尔滨150086;哈尔滨医科大学微生物学教研室、黑龙江省感染与免疫重点实验室,哈尔滨150086;哈尔滨医科大学微生物学教研室、黑龙江省感染与免疫重点实
验室,哈尔滨150086;哈尔滨医科大学微生物学教研室、黑龙江省感染与免疫重点
实验室,哈尔滨150086;哈尔滨医科大学微生物学教研室、黑龙江省感染与免疫重
点实验室,哈尔滨150086;哈尔滨医科大学微生物学教研室、黑龙江省感染与免疫
重点实验室,哈尔滨150086;哈尔滨医科大学微生物学教研室、黑龙江省感染与免
疫重点实验室,哈尔滨150086
【正文语种】中文
博尔纳病病毒(Borna disease virus，BDV)是一种嗜神经性的单股负链RNA病毒，属于单股负链RNA病毒目(Mononegavirales)。

因其在细胞核中复制和转录，并伴有RNA拼接、转录通读(read through)和开放读码框架重叠等特征，被命名为博尔纳病病毒科。

BDV基因组全长8.9 kb，有6个开放读码框架，其中编码磷蛋白(P24)的基因序列比较保守，变异小，从而成为检测该病毒核酸的特异性标志物。

本研究通过制备BDV特异性的BDV p24正链探针，检测BDV在脑组织内的感染与分布情况。

1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 质粒重组质粒pBluescript skⅡ(-)p24是BDV p24基因反向插入pBluescript skⅡ(-)载体而构建的克隆质粒，重组质粒pQE-p24是含有BDV p24基因的克隆质粒，由本实验室制备。

1.1.2 细胞、病毒及大鼠脑组织石蜡块来源于人类少突胶质细胞瘤的永生细胞系(oligodendroglioma cell line，OL细胞)、BDV持续感染的OL细胞、B组柯萨
奇病毒(coxsackievirus B，CVB)3型急性感染的OL细胞、Wistar大鼠颅内接种BDV(H1766株)后不同时间点的脑组织石蜡块以及正常Wistar大鼠脑组织石蜡块
均由本实验制备。

1.1.3 主要试剂 DIG RNA labeling kit (Roche)，DIG nucleic acid detection kit (Roche)，BamHⅠ限制性内切酶 (NEB)，硝酸纤维素膜和原位杂交专用盖玻片(武汉博士德)，碱水解液(0.4 mol/L NaHCO3、 0.6 mol/L Na2CO3)，洗液(0.1
mol/L maleic acid、 0.15 mol/L NaCl、 0.3% Tween-20)，检测液(0.1 mol/L Tris-HCl、 0.1 mol/L NaCl)，预杂交液(50% formamide deionized、2×SSC、50 mmol/L HEPES、5×Denhardt’s solution、250 μg鲑鱼精DNA/ml)均由
本实验室配制。

1.2 方法
1.2.1 BDV p24 正链探针的制备应用BamHⅠ酶切pBluescript skⅡ(-)p24质粒，获得制备BDV p24正链探针的模板DNA，应用DIG RNA labeling kit标记BDV p24正链探针。

反应体系包括模板DNA (90 ng/μl) 13 μl、10×NTP labeling mixture 2 μl、10×缓冲液2 μl、protector RNase inhibitor 1 μl、RNA聚合酶
T7 2 μl，总体积20 μl。

37 ℃孵育2 h后用8 mol/L LiCl和70%乙醇纯化，100 μl DEPC水溶解沉淀，并用碱水解液水解至100～300 bp[1]。

用分光光度计检测，BDV p24正链探针浓度为40 ng/μl。

1.2.2 斑点实验(spot test)检测BDV p24正链探针的标记效率将试剂盒中DIG标记的标准品RNA和制备的BDV p24正链探针进行平行的10倍连续梯度稀释，
分别滴加于硝酸纤维素膜上，321 nm紫外线照射交联5 min，DIG抗体(1∶5 000稀释)37 ℃孵育1 h；然后用洗液洗3次，每次5 min；检测液洗2次，每次
5 min；1×NBT/BCIP室温显色，观察到紫色斑点形成时终止反应。

1.2.3 斑点杂交法(dot hybridization)检测BDV p24正链探针的特异性将pQE-
p24质粒以及分别从OL细胞、BDV持续感染的OL细胞、CVB急性感染的OL
细胞中提取的总RNA滴加在硝酸纤维素膜上，用BDV p24正链探针(1 ng/μl)进
行杂交，经抗体孵育和显色，确定探针的特异性。

1.2.4 原位杂交法(in situ hybridization)检测大鼠脑组织中BDV基因组取
BDV(H1766株)颅内接种和正常Wistar大鼠脑组织石蜡切片，脱蜡水化，0.1
mol/L Tris (pH 7.5)室温浸泡5 min，100 μg/ml蛋白酶K 37 ℃消化20 min，4%聚合甲醛室温固定10 min；0.2%甘油/0.1 mol/L Tris溶液中室温浸泡5 min，滴加无水乙醇37 ℃干燥15 min；预杂交缓冲液37 ℃孵育30 min；每个样品滴加20 μl杂交液(BDV p24正链探针浓度为2 ng/μl)，50 ℃孵育18 h；2×SSC室温漂洗3次，每次5 min；0.2×SSC 57 ℃漂洗3次，每次10 min；洗液漂洗3次，每次5 min；10%封闭液37 ℃封闭30 min；经抗体孵育和显色，观察结果并照相，脱水封片后保存。

2 结果
2.1 BDV p24正链探针的标记效率
直接将稀释后的试剂盒中DIG标记的标准品RNA和BDV p24正链探针分别滴加于硝酸纤维素膜上，进行斑点实验。

结果显示，BDV p24正链探针的标记效率与
试剂盒中标准品RNA的标记效率一致，可检测到最低浓度为4 pg/μl的RNA。

表明本实验制备的探针可用于原位杂交检测(图1)。

a，b，c，d，e，f: RNA at different concentrations (40 ng/μl，4 ng/μl，400 pg/μl，40 pg/μl，4 pg/μl，0.4 pg/μl) on nitrocellulose filter，respectively. Labeling efficiency of BDV p24 sense probe is coincident with the labeled control RNA.
图1 斑点实验检测BDV p24正链探针的标记效率
Fig 1. Detection of labeling efficiency of BDV p24 sense probe by spot test 2.2 BDV p24正链探针的特异性
将pQE-p24质粒以及分别从OL细胞、BDV持续感染的OL细胞、CVB急性感染的OL细胞中提取的总RNA滴加于硝酸纤维素膜上，进行斑点杂交实验。

可见BDV p24正链探针可与pQE-p24质粒、BDV持续感染的OL细胞的总RNA结合，呈现棕色斑点，但与OL细胞、CVB急性感染OL细胞的总RNA无反应，表明BDV p24正链探针具有BDV基因组的特异性(图2)。

a: pQE-p24 plasmid; b: total RNA from OL cells; c: total RNA from OL cells with persistent BDV infection; d: total RNA from OL cells with acute CVB infection.
图2 斑点杂交法检测BDV p24正链探针的特异性
Fig 2. Detection of specificity of BDV p24 sense probe by dot hybridization 2.3 原位杂交法检测大鼠脑组织中BDV基因组
对BDV(H1766株)颅内接种及正常Wistar大鼠脑组织的石蜡切片进行原位杂交实验。

结果显示， BDV接种大鼠的脑组织石蜡切片中，BDV基因组主要散在分布于海马和皮质神经元细胞核内，呈紫蓝色点状颗粒；接种3周后，BDV感染主要发生在皮质和海马区，少量侵犯丘脑及下丘脑；接种6周后，皮质和海马区BDV感染仍持续存在，且丘脑和下丘脑内BDV感染明显增强；正常大鼠的脑组织石蜡切片中无阳性反应信号产生(图3A)。

对BDV接种3周和6周时大鼠脑组织石蜡切片(各5张)中的不同区域进行观察，并比较BDV基因组阳性细胞计数，发现这2个
时间点丘脑和下丘脑区域的BDV阳性细胞数均有显著差异(P<0.05,t检验)(图3B)。

A: Detection of BDV genome in the paraffin brain sections of normal and BDV-inoculated Wistar rats by in situ hybridization. a: hippocampus from normal Wistar rat brain; b，c，d，e: hippocampus，cortex，thalamus，
and hypothalamus from Wistar rat brain at the third week post-BDV inoculation，respectively; f: cortex from Wistar rat brain at the third week post-BDV inoculation; g: cortex from normal Wistar rat brain; h，i，j，k: hippocampus，cortex，thalamus，and hypothalamus from Wistar rat brain at the sixth week post-BDV inoculation，respectively; l: cortex from normal Wistar rat brain. Scale bars,400 μm(a-e; g-k)and 100 μm(f，l). B: Comparison of number of positive cells in different brain regions of BDV-inoculated Wistar rat at different time points(*P<0.05).
图3 原位杂交法检测BDV接种Wistar大鼠脑组织中BDV基因组
Fig 3. Detection of BDV genome in the brain of BDV-inoculated Wistar rat by in situ hybridization
3 讨论
BDV持续感染的自然宿主以马和羊等家畜为主，在实验条件下几乎可感染所有温血动物。

大鼠接种BDV可成为研究嗜神经病毒诱导的中枢神经系统免疫病理损伤的模型。

大鼠在接种BDV 14 d后主要出现共济失调、攻击性增强、活动增加等状况，脑内的病理表现为软脑膜和血管周围有单核细胞浸润，BDV核酸在神经元内广泛分布；而在接种BDV 31 d后主要出现食欲减退、嗜睡、情感冷漠、四肢麻痹等状况，脑内的病理表现为皮质、海马、杏仁核和丘脑区域淋巴细胞、巨噬细胞、浆细胞等炎症细胞明显增多，BDV核酸也分布在星形胶质细胞和神经膜细胞(Schwann cell)内，并伴有神经元的溶解和华沃变性(Wallerian degeneration)，提示在神经元溶解后BDV主要存在于星形胶质细胞和神经膜细胞内，维持病毒感染状态[2-5]。

沙鼠接种BDV后，中枢神经系统免疫病理损伤不明显，发病沙鼠脑内BDV主要在低位脑干(中脑、延髓、脑桥和小脑)中复制，而且沙鼠只有在发病后小脑内的浦肯野细胞(Purkinje cell)中才检测到BDV核酸；未发病的沙鼠脑内
BDV主要在皮质和海马的神经元内复制，在低位脑干中很少能检测到BDV核酸，表明症状的发生与否与BDV在沙鼠脑内的主要复制部位有关[1]。

本研究用原位杂交法检测BDV接种的Wistar大鼠脑组织的石蜡切片，可见接种3周后BDV感染主要发生在皮质和海马区域，仅少量发生于丘脑和下丘脑；接种6
周后皮质和海马内BDV感染仍持续存在，且丘脑和下丘脑BDV感染明显增强，
即BDV可对大鼠脑内某些区域或细胞类型优先选择。

随着感染时间的延长，感染范围逐步扩大，为研究BDV接种Wistar大鼠后不同时间点BDV在脑组织中的分布情况以及明确感染部位与临床表现之间的关系提供了可能。

因此，可应用原位杂交法研究病毒经不同途径(鼻后、经颅、皮垫)接种实验动物后随感染时间的延长而在体内的分布情况，从而解释所出现的不同发病特征。

体外细胞实验发现，BDV
感染存在两种情况，即高水平表达的持续感染和低水平表达的潜伏感染[6]。

至于
实验动物体内是否也存在低水平表达的潜伏感染，及此时该动物处于何种生存状态等问题迄今尚不清楚。

针对BDV的基因组、mRNA和编码的蛋白质可分别设计探针和制备抗体，建立应用原位杂交和免疫组化法对BDV接种动物进行检测的模型，从而探讨BDV的致病机制。

参考文献
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