RT-PCR的具体步骤

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RT-PCR的具体步骤

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加1mlTRIzol
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组织：匀浆(彻底，分几次打，是匀浆时产生的热量能散出，后转至EP管)
细胞：用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块
↓
颠倒混匀10下，室温5分钟
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加氯仿1/5体积(0.2ml)(必须按总体积的1/5)
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颠倒混匀10下，室温5分钟
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4℃，离心12000g，15分钟
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转上层水相(约400μl)于另一1.5mlEP管中
(第二步：PCR反应：总体积20μl，如果50μl体系，相应加倍)
试剂浓度体积终浓度
Taq Buffer 10× 2μl 1×
MgCl2 25mM 1.2μl 1.5mM
dNTP 10mM 0.2μl
上游引物10pmol/μl 0.4μl
下游引物10pmol/μl 0.4μl
cDNA模板1μl
DEPC水14.7μl
3.RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年。
4.弃上清的操作，我们一般将EP管倒置在平铺于桌面的卷纸上，吸干。
5.最后一步弃酒精，将RNA溶于DEPC水的操作，我们的做法是：先按4的步骤吸干酒精，其实这样还是不彻底的，再将EP管小离心后用20μl小枪头(DEPC处理过的)吸出多余的酒精。最后用200μl中枪头(DEPC处理过的)吸11.5μl(20μl体系，如果是40μl体系则加倍)的DEPC水至EP管中，吹打助溶，然后转移至200μl的EP管(这些EP管中可以事先加好Oligo(dT)15，以节省枪头)中。
五．琼脂糖凝胶配制
1．1.0%：1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉加热至沸腾(如果首次煮胶，一定要煮透，以不出现泡沫为标志)，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min(可以放入4度冰箱加快琼

RT-PCR的具体步骤

RT-PCR的具体步骤RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种常见的分子生物学技术，用于检测RNA分子。

在本文中，我们将介绍RT-PCR的具体步骤，以便您更加全面地了解这种技术。

1.总RNA提取首先需要从细胞中提取RNA。

这可以通过商用试剂盒或手工方法实现。

如果使用试剂盒，则遵循其说明书中的步骤。

如果手工提取RNA，则需要使用三个基本试剂：细胞裂解缓冲液、氯仿和异丙醇。

步骤如下：•将细胞收集在管中，加入裂解缓冲液。

•冷冻-解冻样品3次，使细胞壁破裂并释放RNA。

•加入氯仿并混合。

•离心样品，使沉淀分离出来。

•将上层溶液转移到另一个管中，加入异丙醇。

•冷藏或冷冻，然后离心。

•去除上层液体，并在无水酒精中对RNA进行洗涤和沉淀。

2.反转录在提取出RNA后，需要将其转录为DNA，即逆转录。

这可以通过使用反转录酶（RT）实现。

在反转录步骤中，会加入反转录引物和其他试剂来增强逆转录效果。

这些引物是由需要扩增的RNA序列的反向互补核酸序列构成的。

这些步骤如下：•将RNA加入反转录反应混合物中，该混合物包含反转录酶、引物和其他必要试剂。

•反转录混合物通常通过加热来促进逆转录引物结合到RNA模板上，并形成RNA-DNA杂交链。

随后，反转录酶在杂交链上寻找RNA模板，并通过降低杂交链的熔点来将反转录引物延伸为cDNA链。

3.PCR扩增完成逆转录后，需要进行PCR扩增以增加cDNA的数量。

PCR是一种将 DNA 扩增到数以百万计的技术，能够扩增非常小的DNA模板。

PCR的步骤如下：•在PCR反应混合物中加入适当的引物和其他必要试剂。

•该反应混合物包括DNA聚合酶、模板DNA、引物和核苷酸。

•反应混合物被放入PCR机器中，按照特定的程序进行加热和冷却，使DNA链复制为两条新的DNA链。

•扩增程度由PCR反应的周期数决定。

4.分析最后，将扩增的DNA分离并分析它们的大小、类型和量。

这可以通过游离电泳或毛细管电泳等技术实现。

RT-PCR实验步骤

RT-PCR实验步骤一、总RNA提取1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。

2. 震荡30s。

3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。

4. 12000×g，4℃离心，15min。

5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。

6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。

7. 12000×g，4℃离心，10min。

在管底部可见微量RNA沉淀8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。

9. 7500×g，4℃离心，10min。

10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。

11. 沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD28012. 计算浓度与纯度，-70℃保存。

二、逆转录合成cDNA第一链反应体系如下混匀快速离心一次反应条件如下-20℃ 冰箱冻存三、PCR反应混匀快速离心一次反应条件如下PCR产物-20℃冰箱保存取PCR产物8μl 加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。

100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。

RT-PCR实验方法总结1,2RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。

要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。

2. RT按要求做，一般不会出太大问题。

3. PCR，按常规。

但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。

1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。

如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。

rt-pcr反应步骤

rt-pcr反应步骤
RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种用于检测RNA的技本。

它可以将RNA转录成DNA，然后进行聚合酶链式反应来扩增特定的DNA片段。

以下是RT-PCR的一般步骤：
1. 样品处理，首先需要从样品中提取RNA。

这包括细胞或组织
的裂解以释放RNA，并使用适当的试剂将RNA纯化出来。

2. 逆转录，提取的RNA经过逆转录反应，使用逆转录酶（如
M-MLV逆转录酶）将RNA转录成相应的cDNA（互补DNA）。

3. PCR准备，为了进行PCR，需要将逆转录产生的cDNA与引物（primer）和DNA聚合酶（如Taq聚合酶）放入PCR反应管中。

引
物是一小段与目标DNA序列互补的DNA片段，它们将指导DNA聚合
酶在特定区域合成新的DNA链。

4. PCR扩增，PCR反应进行数个循环，每个循环包括三个步骤，变性、退火和延伸。

在变性步骤中，反应混合物被加热以使DNA解链。

在退火步骤中，引物与目标DNA结合。

在延伸步骤中，DNA聚
合酶在引物的引导下合成新的DNA链。

这些循环会使目标DNA片段
指数级增加。

5. 结果分析，最后，通过凝胶电泳或其他技术，可以分析PCR 反应产生的DNA片段，确定是否存在感兴趣的基因或RNA。

总的来说，RT-PCR是一个用于检测和定量RNA的强大技术，它结合了逆转录和聚合酶链式反应的步骤，可以在研究和临床诊断中发挥重要作用。

Rt－PCR实验操作步骤

Rt－PCR实验操作步骤RT-PCR实验操作步骤（转）默认分类2007-12-25 17:51:05 阅读233 评论1 字号：大中小订阅一.所用试剂1.0.01MPBS缓冲液,PH7.4 ：高压灭菌，40C保存。

临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。

2.焦碳酸二乙酯(DEPC)：sigma公司，40C保存。

3.0.1%DEPC处理的灭菌去离子水：100ml去离子水中加入0.1mlDEPC，剧烈振荡混匀，让DEPC充分进入溶液中，370C放置过夜，高压蒸汽灭菌30分钟除去DEPC。

40C保存。

4.单相细胞裂解试剂TRizoL：Invitrogen生命技术公司，40C保存。

临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。

5.氯仿：用新开封的，10ml分装，40C保存。

临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。

6.异丙醇：用新开封的，20ml分装，40C保存。

临用前－200C 放置30分钟，确保冰冷。

7.0.1%DEPC处理的75％乙醇：无水乙醇75ml加0.1%DEPC处理的灭菌去离子水至100ml，4C保存。

临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。

8.cDNA反转录试剂盒：MBI公司，－200C保存。

9.2xPCR试剂：MBI公司，－200C保存。

10.5xTBE RNA电泳缓冲液：因为Tris碱可与DEPC发生反应并使之失活，所以含Tris碱的电泳缓冲液可用DEPC处理的灭菌去离子水配制，0.22um滤器过滤除菌。

室温保存，临用前用DEPC处理的灭菌去离子水10倍稀释。

使用本室RNA专用电泳槽，每次需配制0.5x 电泳缓冲液500ml。

11.50xTAE DNA电泳缓冲液：室温保存，临用前用去离子水50倍稀释。

使用本室DNA专用电泳槽，每次需配制1x电泳缓冲液1000ml。

12.6x上样缓冲液：1.5mlDEPC处理的灭菌离心管中称取2.5mg 溴酚蓝，加入0.3ml甘油，DEPC处理的灭菌去离子水定容至1ml，40C保存。

rt-pcr的步骤和注意事项

RT-PCR的步骤和注意事项RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA的数量和表达水平。

下面是RT-PCR的基本步骤和一些需要注意的事项。

步骤1.提取RNA：RT-PCR的第一步是从样品中提取RNA。

常见的方法包括酚/氯仿提取法和商用RNA提取试剂盒。

2.逆转录：逆转录是将RNA转录成cDNA的过程。

逆转录反应需要逆转录酶和引物。

在逆转录反应中，RNA被逆转录酶逆转录为单链cDNA。

3.退火：将逆转录产生的单链cDNA进行退火，以得到双链cDNA。

退火的温度和时间应根据引物的特异性进行优化。

4.PCR扩增：将退火得到的双链cDNA作为模板进行PCR扩增。

PCR扩增需要DNA聚合酶和引物。

PCR扩增的温度和时间也应根据引物的特异性进行优化。

5.分析产物：将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析或者实时荧光定量PCR分析，以检测和定量RNA的表达水平。

注意事项在进行RT-PCR实验时，有几个注意事项需要遵守：1.RNase污染：RNase是一种可以降解RNA的酶，极易污染实验室环境。

为了避免RNase污染，所有操作前都应使用RNase去除液对实验表面进行彻底清洁，并在操作过程中使用RNase-free的试剂和器具。

2.质控：在RT-PCR实验中应常规进行阴性对照和阳性对照。

阴性对照是用纯水代替RNA模板，而阳性对照是使用已知含有目标RNA的样品。

质控实验的结果应该符合预期，以确保实验的准确性和可靠性。

3.引物设计：引物是RT-PCR实验中非常重要的因素，合适的引物设计可以提高实验的特异性和灵敏度。

引物的选择应避免自身互补性，长度一般为18-24个碱基，GC含量在40-60%之间。

此外，引物的Tm值应相近，以确保PCR扩增的效果。

4.反应体系：RT-PCR反应体系的准备需要精确的计量。

反应的组分通常包括模板RNA，引物，逆转录酶，逆转录缓冲液，核苷酸混合液，PCR缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs和MgCl2等。

rtpcr步骤及原理

rtpcr步骤及原理RTPCR步骤及原理摘要：反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种常用的分子生物学技术，用于定量检测RNA或DNA中特定序列的数量。

本文将介绍RTPCR的步骤和原理，包括反转录、PCR扩增和结果分析等方面。

同时也会讨论RTPCR的优点、限制和在科研和临床中的应用。

引言在生物医学研究和临床实践中，准确测定RNA或DNA中特定基因或序列的表达水平或存在数量是非常重要的。

反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种被广泛应用的技术，能够对目标序列进行定量和扩增。

一、反转录反转录是RTPCR的第一步，也是从RNA到cDNA的转录过程。

这一步骤利用反转录酶将RNA模板转录成互补的cDNA。

反转录的关键是一条RNA模板和逆转录酶的结合，逆转录酶能够将RNA依据其互补碱基配对的原则合成cDNA。

反转录需要一些关键的试剂，如RNA模板、逆转录酶、引物和dNTPs等。

RNA模板是目标序列的来源，逆转录酶则是反转录的关键酶。

引物是用于使逆转录酶能够开始合成cDNA运输链的小片段，而dNTPs则是逆转录酶用来合成cDNA的原料。

二、PCR扩增PCR扩增是RTPCR的第二步，也是从cDNA扩增目标序列的过程。

PCR扩增是利用聚合酶将靶DNA序列经过多次循环扩增成数量可检测的水平。

PCR扩增需要两个引物，一个用于标记出序列的起始点，一个用于标记出序列的终止点。

PCR扩增需要通过一系列的循环反应来不断扩增目标序列。

每个循环有三个关键步骤：变性、退火和延伸。

变性是通过高温来使DNA 的两个链分离，退火是通过低温使引物与靶序列结合，延伸则是通过温度合适的聚合酶来合成新的DNA链。

三、结果分析RTPCR的结果分析可以通过几种不同的方法进行，最常见的是凝胶电泳和实时定量PCR。

凝胶电泳是一种常见的分离DNA片段的方法，可以将PCR扩增的产物根据大小分离成不同的带状，在凝胶上的迁移速率还可以推测出片段的大小，并对扩增的特定基因进行定性和定量分析。

RT-PCR全过程步骤

RT—PCR全过程步骤一．试剂材料准备1、塑料制品：(包括枪头、EP管、匀浆管等）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管)2、玻璃制品:泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）(洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC)三、试剂配制：1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。

2、75%乙醇：用无水乙醇DEPC水配，然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压）3、异丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、琼脂糖二．总RNA提取1. 取100mg组织，放到1。

5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。

（1)液氮研磨，组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50—100mg 组织/ml Trizol 加入Trizo l，转入离心管进行第2 步操作。

(2）匀浆：组织样品按50—100mg/mlTrizol 加入Trizol。

另外,组织体积不能超过Trizol 体积的10％，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1—2 分钟.2. 震荡30s，室温放置5min，使其充分裂解。

12，000rpm 离心5min，弃沉淀。

3. 加0.2ml氯仿，摇动30s,室温5-10min。

注：禁用漩涡振荡器,以免基因组D NA 断裂。

4。

12000×g，4℃离心,15min。

5. 吸上层无色水相,移入另一EP管中（约0.5ml）。

6. 加等体积异丙醇，室温放置5—10min。

7。

12000×g,4℃离心,10min。

在管底部可见微量RNA沉淀8. 弃上清，加冰预冷75%乙醇1ml，温和振荡，悬浮沉淀。

RT-PCR步骤

RT-PCR实验步骤1、引物设计2、 RNA提取1) 离心管中，取150ul的淋巴细胞，加入1ml Trizol试剂2) 静置5分钟或马上-70℃保存3) 12000 rpm 离心15分钟,分相为三层，取上清液至新管4) 加入200ul氯仿，振荡混均30秒5) 室温静置3-5分钟分层6) 12000rpm离心15分钟，取上清液至新管，中间层和红色下层4℃保存，便于提取DNA 和蛋白质7) 上清液加入约的异丙醇（预冷）,振荡混均30秒，室温下静置15分钟8) 12000rpm离心10分钟，弃上清，RNA沉淀管底。

9) 如沉淀不明显，则再离心数秒吸出上清10) 加入1ml 75%乙醇（预冷），温和震荡悬浮沉淀11) 8000 rpm离心5 min,弃上清12) 短暂快速离心（5秒），吸弃上清13) 室温放置2分钟晾干14) 沉淀加入15ul DEPC处理水，轻弹管壁溶解15) 少量样品55-60℃孵育10～15分钟16) 测量OD A260/A280值后，样品放置－70℃保存。

(保存时间不应超过一星期)3、反转录用琼脂糖电泳抽样检测RNA的纯度，如果杂质较多，则需要加DNA酶进行去杂。

然后在进行反转录步骤（购买反转录试剂盒）。

反转录步骤初步定为：1）离心管加入1μl总RNA，1μl随机引物oligo(dt），10μlDEPC处理水。

2）混匀，瞬时离心5秒。

3）70℃水浴5min。

4）迅速冰浴2min。

5）瞬时离心，加入4 ul 5× Buffer, 2 ul DTT, 2 ul 10Mm dNTPs。

6）混匀，温浴2min。

7）加入1 ul 反转录酶，42℃温育50min。

8）70℃孵育10min灭活。

9）-70℃冰箱。

4、 PCR条件优化为了寻求PCR最适DNA模版浓度和引物浓度，采用交叉法分别对模版和引物进行梯度稀释，交叉进行PCR反映，确定最佳浓度搭配。

(1) 反应体系：SYBR Premix Ex Taq 10μl PCR Forward Primer μlPCR Reverse Primer μl ROX Reference Dye μlDNA模板μl dH2O μlTotal 20μl(2) 反应条件Stage 1：预变性 Reps：195℃，30sStage 2：PCR反应 Reps：4095℃ 5s 60℃ 30s(3) 2块96孔板反应最佳条件，即模板（cDNA）浓度和不同目的基因引物浓度a：DNA模版浓度（稀释倍数）b：特异性引物浓度c：不同基因A、B、C、D：DNA模版浓度梯度A1、A2、。

RT-PCR实验步骤

(1)RNA提取1、取出新鲜肝组织，放在液氮中冻存备用。

2、取匀浆器，加入lml的Trizol Reagent，置冰上预冷。

3、取100mg新鲜肝组织，加入到匀浆器中。

4、充分研磨直至无可见组织块，转移到1.5ml EP管中。

(2)两相分离每lml的Trizol Reagent试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。

手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。

4C下12000rpm离心15分钟。

离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。

RNA全部被分配于水相中。

水相上层的体积大约是匀浆时加入的Trizol Reagent试剂的60％。

(3)RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。

加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30C孵育10分钟后，于4C下12000rpm离心10分钟。

此时离心前不可见的RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

(4)RNA清洗移去上清液，每lml Trizol Reagent试剂裂解的样品中加入至少lml的75％乙醇(75％乙醇用DEPC H2O配制)，清洗RNA沉淀。

混匀后，4C下7000rpm离心5分钟。

(5)RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

(6)溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40u1用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80C待用。

(7)测定RNA的质量1)紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。

然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。

①浓度测定：A260下读值为1表示40 ug RNA/ml。

样品RNA浓度(ug/m1)计算公式为：A260×稀释倍数×40 ug／ml。

具体计算如下：RNA溶于4u1 DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495 ul的TE中，测得A260=0.21RNA浓度=0.21×100×40ug/ml=840ug/ml或0.84ug/ul取5ul用来测量以后，剩余样品RNA 为35u1，剩余RNA总量为：35u1×0.84 ug/ul=29.4 ug②纯度测定：RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

RT-PCR的操作方法(终极版)

qRT-PCR实验步骤一、试剂准备1. 自备试剂：75%乙醇（以去RNAase H₂O配置）、氯仿、异丙醇、无RNAase H₂O。

2. 相关试剂盒（给出货号）等。

3. 无菌的epp管、PCR管、tip头等耗材。

二、注意事项1. 全称佩戴手套、口罩，穿白大褂。

女生需将长发扎起。

2. 自2.3至3.1步骤，必须使用无RNAase耗材（包括枪头和epp管）。

3. 所有试剂专用，不得与其他实验混用。

三、实验步骤1. 样品准备1.1. 动物组织：取新鲜或-70°C冻存组织，每30-50 mg 组织在液氮中充分研磨，也可以加入1 ml TotalRNAExtractor，用匀浆器匀浆处理。

样品体积一般不要超过TotalRNAExtractor 体积的10%。

1.2 单层培养细胞的收集：可直接在培养容器中裂解（培养面积不超过10 cm2，细胞不超过1×107），或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。

a. 直接裂解法：吸弃培养液，PBS清洗一次。

直接在培养板中加入TotalRNAExtractor 裂解细胞，每10 cm2面积加1-2ml TotalRNAExtractor（6孔板一般使用500-1000ul)。

用移液器吹打混匀。

TotalRNAExtractor 加量根据培养板面积决定，而不是由细胞数决定，如果加入的量不够，将导致提取的RNA 中有基因组DNA 污染。

b. 胰蛋白酶处理法：收集细胞并大致确定细胞数量，用PBS 洗涤细胞后，向细胞中加入含有0.1-0.25%胰蛋白酶的PBS 处理细胞，当细胞脱离容器壁后，加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至无RNase 的离心管中，5000 rpm 离心 5 min，收集细胞沉淀，去除上清，PBS重悬，清洗一次，离心去上清。

每10 cm2面积加1 ml TotalRNA Extractor。

用移液器吹打混匀。

收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则裂解不完全，降低RNA 得率。

RTpcr实验步骤

RT-PCR实验步骤RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的实验技术，可以在体外合成DNA的互补链。

它广泛应用于分子生物学研究、病毒检测以及基因表达分析等领域。

下面将介绍RT-PCR实验的步骤。

材料准备在进行RT-PCR实验之前，需要准备以下实验材料：1.逆转录试剂盒：包括逆转录酶、引物、缓冲液等。

2.样品：需要包含RNA的样品，如细胞总RNA或组织RNA。

3.质控物：用于验证实验的阴性和阳性对照物。

4.相关试剂：如脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）、MgCl2、RNase抑制剂等。

逆转录反应前处理1.将RNA样品加入无RNase试剂管中，以免被RNase降解。

2.加入逆转录酶、逆转录缓冲液、dNTP、MgCl2和RNase抑制剂，轻轻混合。

反应条件1.设置逆转录反应的温度和时间：通常在50-60摄氏度下反应10-60分钟，以逆转录酶的要求为准。

2.根据逆转录酶的要求进行热变性处理，以停止反应。

PCR扩增准备PCR反应液1.在无RNase的条件下，制备PCR反应液。

组分包括引物、dNTP、PCR缓冲液和PCR酶。

2.在无样品的条件下，混合PCR反应液。

反应条件1.设置PCR反应的循环条件：包括变性、退火和延伸温度，循环次数根据需求而定。

2.在PCR反应过程中收集产物供进一步分析和检测。

结果分析通过PCR扩增获得的产物可以进行各种分析和检测。

1.凝胶电泳：将PCR产物与DNA分子量标准一同在琼脂糖凝胶上进行电泳，通过电泳图观察目标DNA的条带。

2.定量PCR：通过测定PCR反应体系中初始DNA的数量，可以计算出初始样品中的目标DNA的初始数量。

3.实时荧光定量PCR：结合荧光染料和合适的探针，可以实时监测PCR反应体系中目标DNA的扩增过程。

结论RT-PCR实验是一种重要的分子生物学技术，能够在体外合成DNA的互补链。

通过逆转录反应和PCR扩增，可以获得目标DNA的大量复制产物，并通过结果分析方法进行进一步研究。

rt pcr的常用方法

rt pcr的常用方法rt-PCR( real-time PCR )是一种用于检测和定量新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸的技术。

下面是 rt-PCR 的常用方法及其拓展:1. 设计引物:rt-PCR 的第一步是设计引物。

引物是探针分子,用于结合目标核酸,并用于在 rt-PCR 中扩增目标核酸。

引物的质量和准确性对 rt-PCR 的结果至关重要。

通常,引物由两个互补的短链组成,分别位于引物的两端。

引物的长度和结构可以影响 rt-PCR 的反应时间和结果。

2. 提取核酸:从患者或样本中提取足够的核酸是 rt-PCR 的第一步。

通常,需要使用核酸提取试剂盒,将患者或样本中的核酸提取出来。

核酸提取的准确性和效率对 rt-PCR 的结果也有很大的影响。

3. 混合核酸:将提取的核酸与引物一起混合,并使用 rt-PCR 试剂盒进行扩增。

扩增过程中,引物将与目标核酸结合,并生成一个反应物。

这个反应物可以在rt-PCR 中测量,并计算出病毒的数量。

4. 控制温度和湿度:rt-PCR 的反应需要一定的温度和湿度条件。

通常,需要使用专门的 rt-PCR 设备,并将设备放置在适当的温度和湿度环境中。

这有助于提高 rt-PCR 的准确性和效率。

5. 数据分析:一旦扩增了目标核酸,就需要对数据进行分析。

通常,使用rt-PCR 数据分析软件对数据进行处理和可视化。

这可以帮助确定扩增是否成功,并确定病毒的数量。

rt-PCR 是一种快速、准确和灵敏的方法来检测和定量新型冠状病毒。

通过设计合适的引物,提取足够的核酸,并将核酸与引物一起混合,并控制温度和湿度,可以提高 rt-PCR 的准确性和效率。

RT-PCR步骤

RT-PCR实验步骤1、引物设计2、 RNA提取1) 1.5ml 离心管中，取150ul的淋巴细胞，加入1ml Trizol试剂2) 静置5分钟或马上-70℃保存3) 12000 rpm 离心15分钟,分相为三层，取上清液至新1.5ml管4) 加入200ul氯仿，振荡混均30秒5) 室温静置3-5分钟分层6) 12000rpm离心15分钟，取上清液至新1.5ml管，中间层和红色下层4℃保存，便于提取DNA和蛋白质7) 上清液加入约0.5ml的异丙醇（预冷）,振荡混均30秒，室温下静置15分钟8) 12000rpm离心10分钟，弃上清，RNA沉淀管底。

(保存时间不应超过一星期)3、反转录用琼脂糖电泳抽样检测RNA的纯度，如果杂质较多，则需要加DNA酶进行去杂。

然后在进行反转录步骤（购买反转录试剂盒）。

反转录步骤初步定为：1）0.2ml离心管加入1μl总RNA，1μl随机引物oligo(dt），10μlDEPC处理水。

2）混匀，瞬时离心5秒。

3）70℃水浴5min。

4）迅速冰浴2min。

5）瞬时离心，加入4 ul 5× Buffer, 2 ul 0.1M DTT, 2 ul 10Mm dNTPs。

6）混匀，温浴2min。

7）加入1 ul 反转录酶，42℃温育50min。

8）70℃孵育10min灭活。

9）-70℃冰箱。

4、 PCR条件优化为了寻求PCR最适DNA模版浓度和引物浓度，采用交叉法分别对模版和引物进行梯度稀释，交叉进行PCR反映，确定最佳浓度搭配。

汇总——RT-PCR详细步骤

实验一哺乳动物细胞总RNA的提取、电泳（定量）实验二反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳实验一哺乳动物细胞总RNA的提取、电泳一、实验目的学习并掌握总RNA的分离提取，检测质量以及定量的方法。

二、实验原理细菌的总RNA主要由rRNA、tRNA及mRNA组成，其中rRNA含量最多（占80%~85％）。

在pH 6.0微酸环境下，RNA相对稳定，碱性环境下，易分解。

RNA酶极为稳定且广泛存在于细胞内外，环境中存在大量RNA酶，极易降解RNA，因而在RNA提取及相关分析实验中，如何避免RNA酶的污染及抑制内源和外源性RNA活性,是实验成败的关键。

RNA的产量取决于组织或细胞的来源，但是，通常每毫克组织可获得4~7μg RNA，每106细胞可获得5~10μg RNA，提取的RNA A260/A280比值一般为1.8~2.0。

在RNA相关实验过程中，须树立RNase-free思想：1）样品新鲜，保存得当，以强变性剂，防止内源性RNase；2）人体上遍布RNase,养成操作时勤换一次性手套和口罩的好习惯；3）空气中灰尘和细菌含RNase，应建立干净的操作环境；实验介绍如何使用TRIzol来分离总RNA。

TRIzol是一种酸性苯酚提取试剂，含有去垢剂，和使RNase失活的异硫氰酸胍，它能在破碎和溶解细胞时保持RNA的完整性，防止RNA降解。

（注意：TRIzol 具有强烈腐蚀作用，小心操作。

）三、实验材料、试剂与器材1、细胞（5х106Hela）2、DEPC水溶液，PBS，TAE3、氯仿，异丙醇，乙醇均为分析纯4、TRIzol试剂购自Invitrogen5、烧杯（1000，500，100，50ml若干），量筒（1000，500，250，50，20 ml若干），玻璃棒，药勺，试剂瓶，三角瓶。

枪头（1000、200、20 ul），离心管(0.2ml、0.5ml PCR管,1.5ml、2ml、7ml离心管)，枪头盒。

rt-pcr操作流程

rt-pcr操作流程如下：
1.RNA提取：从样品（如细胞、组织、血液、唾液等）中提取RNA，
可以使用商业RNA提取试剂盒或自制方法。

2.cDNA合成：利用逆转录酶（Reverse Transcriptase）将RNA转
录成cDNA（DNA的互补链），可以使用商业RT试剂盒或自制方法。

3.建立标准曲线：制备一系列已知浓度的标准品，用以构建标准
曲线，用来定量目标基因的相对表达量。

4.实时荧光定量PCR：将cDNA与引物和荧光探针（如TaqMan
探针）混合，使其在PCR过程中扩增，并且实时检测扩增产物的荧光信号强度，从而判断PCR反应的进程和结果。

5.数据分析：利用软件分析PCR扩增曲线和荧光信号数据，计算
目标基因的相对表达量和差异表达水平。

需要注意的是，RT-PCR操作需要严格控制反应条件和质量，避免污染和误差的影响。

同时，需要针对不同的样品和实验目的进行优化和调整，以获得稳定、可靠和重复的结果。

rt-pcr试验步骤

rt-pcr试验步骤总RNA提取：1．用玻璃或强力匀浆器搅匀组织样品，保存于液氮内样品需要用研钵磨碎，每50~100mg 组织加1ml的裂解液RL后匀浆。

组织样品容积不能超过RL容积的10%。

2．将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15 -30°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。

3．每1mlRL加0.2ml氯仿。

盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。

4．于4℃12，000rpm 离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。

水相层的容量大约为所加RL体积的60%，把水相转移到新管中，进行下一步操作。

5．加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀（此时可能会出现沉淀）。

得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中（吸附柱套在收集管内）。

6．10，000rpm 离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。

7．加500μl 去蛋白液RE，12，000rpm 离心45秒，弃掉废液。

8．加500μl 去蛋白液RD，12，000rpm 离心45秒，弃掉废液。

9．加入700μl漂洗液RW，12,000 rpm 离心60秒，弃掉废液。

加入500μl漂洗液RW，12,000 rpm 离心60秒，弃掉废液。

将吸附柱RA放回空收集管中，12,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。

10．取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，在吸附膜的中间部位加50-80μl RNase free water（事先在65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，12,000 rpm 离心1分钟。

如果需要较多RNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟,或者另外再加30μl RNase free water，离心1分钟，合并两次洗脱液。

如有DNA污染，请用DNAase消化。

cDNA合成：1．在冰浴的试管中加入如下反应混合物：模板RNA：总RNA 2μg引物：Oligo(dT)18 (0.5μg/μl) 1μl无RNA 酶去离子水（RNase-free ddH2O）：定容至11μl。

rtpcr操作流程

rtpcr操作流程RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种用于检测RNA的技术，常用于检测病毒、细菌等微生物的存在。

下面将介绍RT-PCR的操作流程。

首先，准备实验所需的试剂和设备，包括RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR试剂盒、热循环仪等。

确保所有试剂和设备都处于干净、无菌状态。

第二步是提取RNA样本。

将待检测的样本（如血液、组织等）加入RNA提取试剂盒中，按照试剂盒说明书的指导进行RNA提取。

提取后的RNA样本应该是纯净的，没有受到污染。

第三步是逆转录反应。

将提取得到的RNA样本加入逆转录试剂盒中，进行逆转录反应，将RNA转录成cDNA。

逆转录反应的条件和时间根据试剂盒的说明进行设置。

第四步是PCR扩增。

将逆转录反应得到的cDNA加入PCR试剂盒中，进行PCR扩增反应。

PCR扩增的条件包括温度、时间和引物浓度等，需要根据试剂盒的说明进行设置。

第五步是检测PCR产物。

将PCR扩增反应得到的产物进行凝胶电泳或实时荧光定量PCR检测，确定目标基因是否存在。

通过比对标准曲线或者与阳性对照样本进行比较，可以确定目标基因的表达水平。

最后，分析结果并进行数据处理。

根据PCR检测结果，可以判断样本中是否存在目标基因，以及其表达水平。

对数据进行统计分析，得出结论并撰写实验报告。

总的来说，RT-PCR操作流程包括RNA提取、逆转录、PCR扩增、检测PCR产物和数据处理等步骤。

正确操作每一步，严格控制实验条件，可以确保实验结果的准确性和可靠性。

RT-PCR技术在医学、生物学等领域有着广泛的应用，对于疾病的诊断和研究具有重要意义。

RTPCR具体步骤

RTPCR具体步骤RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种用于检测和测量特定RNA分子在样本或样本中的表达水平的实验技术。

下面是RT-PCR的具体步骤：1.提取RNA：首先从样本（可以是细胞或组织）中提取RNA。

这可以通过商业RNA提取试剂盒或经典的酚-氯仿提取法来完成。

提取的RNA可能含有DNA杂质，因此可以使用DNA酶I来去除DNA。

2.逆转录反应：将提取的RNA转录成互补的DNA（cDNA）的过程称为逆转录。

逆转录反应的目的是将RNA转录成cDNA，并将其中的信息保存下来，以便后续PCR反应中进行扩增。

逆转录反应通常在逆转录酶（例如M-MLV反转录酶）和随后使用的引物的存在下进行。

需要引物来诱导逆转录酶在RNA模板上合成第一链cDNA。

3.PCR反应：PCR是一种将特定DNA片段扩增到大量可检测水平的技术。

在RT-PCR中，PCR反应用于扩增从RNA转录的cDNA片段。

PCR反应需要一对引物，这对引物应是特异性的，可以选择性地放大感兴趣的RNA分子。

PCR反应通常包含DNA模板，引物，dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）和DNA聚合酶。

PCR反应包括一系列循环，每个循环都包括一定的时间和温度在一定的时间内。

4.聚合酶链反应：在PCR反应中，DNA聚合酶在每一个循环中以DNA末端为模板合成互补的DNA链。

每个循环包括退火，延伸和变性步骤。

在退火步骤中，引物结合到DNA模板上。

在延伸步骤中，DNA聚合酶合成新的DNA链，并以它们作为模板进一步合成更多的DNA链。

在变性步骤中，PCR反应的温度被升高以分离DNA链。

5.检测与分析：PCR反应产生的扩增产物可以通过凝胶电泳或其他检测方法进行分析。

凝胶电泳可以分离不同大小的DNA片段，并且扩增产物的相对量可以通过定量PCR（qPCR）进行测量。

qPCR使用荧光信号来检测PCR产物的积累，并通过与标准曲线相比较来确定特定的RNA分子在样本中的表达水平。

6.数据分析：通过分析PCR产物的相对量，可以根据比较样品之间的扩增产物浓度来确定特定RNA分子在样本中的表达水平。