OPS法玻璃化冷冻山羊卵母细胞的研究

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绵羊和山羊卵母细胞体外成熟研究进展

绵羊和山羊卵母细胞体外成熟研究进展王中伟，岳顺利，周佳勃∗东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨（150030）E-mail:wzw006336@摘要：本文介绍当前在绵羊和山羊卵母细胞采集和体外成熟方面的研究进展。

卵巢经过促性腺激素处理后能够提高可采集卵泡的数量。

卵母细胞采集方法分为从死亡动物和活体采卵两大类。

死亡动物采卵主要有抽吸法和切割法。

缺点是得到的是不同发育阶段的卵母细胞，而且要牺牲供体的生命。

先进的活体采卵技术有两种分别是腹腔镜采卵和超声波引导阴道穿刺采卵。

它们优点是对母羊损伤小、利用率高。

卵母细胞冷冻保存有助于提高优质卵母细胞的利用率。

最后还阐述了影响卵母细胞质量和产量的因素，例如，激素、血清、卵泡液、生长因子等一些因素的作用。

关键词：绵羊，山羊，卵母细胞，采卵，体外成熟中图分类号：S8111 引言中国养羊业历史悠久，绵羊和山羊品种多样，羊产品也十分丰富。

绵羊和山羊不但具有经济价值，而且可以作为许多疾病研究的很好的实验动物模型。

近些年，国内外在家畜生殖技术研究，特别是在绵羊和山羊的生殖技术方面取得了很大进展，例如第一个体细胞核移植成功的动物就是绵羊。

此外，这些应用在绵羊和山羊上的生殖技术还可用于保护野生濒临灭绝的小型反刍动物[1]。

众所周知，卵母细胞体外成熟（IVM）是进行体外胚胎生产（IVP）、克隆以及辅助生殖（ART）的基础。

本文介绍了目前绵羊和山羊卵母细胞成熟技术的研究进展和影响因素。

2 卵母细胞的采集和保存2.1采集前的促性腺激素处理绵羊或者山羊卵巢经过促性腺激素处理后能够提高可采集卵泡的数量，性未成熟羔羊经促性腺激素处理后也可做为供体[2]。

研究表明，促性腺激素处理羔羊得到的卵母细胞数量高于同样处理的成年山羊，但是二者卵母细胞的体外发育的情况却相似[3]。

绵羊经FSH处理两天得到的卵母细胞的回收率和卵裂率大于处理三天。

在绵羊同步发情实验中发现，恒定剂量处理比递减剂量FSH处理获得的卵母细胞质量更好而且对冷冻保存的耐受能力更强[4]。

胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术

➢ 冷冻过程
快速冷冻法
由室温开始以1℃/min的速度降至-5~-7℃诱发结晶，在此温度下平衡10min℃，然后以0.3℃/min的速度降至30℃~40℃，投入液氮保存。
一步冷冻法
牛和山羊目前仍处于试验阶段
牛7日龄囊胚可在2.1mol/L甘油、0.25mol/L蔗糖混合液中室温下脱水2min，将装有胚胎的细管垂直放在液氮罐颈部 5min，结晶后投入液氮。
非渗透性保护剂
这是一类大分子化合物，能溶于水，性保护剂促使细胞脱水，减少细胞内冰晶形成；组成玻璃化液时，可有效降低渗透性保护剂的分子浓度、可使发生玻璃化的相变温度升高、可促进胞质及保护液玻璃化；解冻时，为卵母细胞和胚胎提供一个高渗环境，避免水分进入胞内过快而产生的渗透性破裂。
冷冻方法
一、卵母细胞的冷冻保存
➢ 卵母细胞的获得活体卵巢采卵屠宰动物卵巢采卵
1.抽吸法 2.切割法 3.剥离法刀片切割卵巢可采取卵巢内部卵泡
➢ 卵母细胞的分级与筛选牛的卵母细胞可分为以下几个等级：
1. A级：外周有3层以上致密卵丘细胞，卵母细胞胞质均匀并充满于透明带内。
2. B级：外周有1~3层卵丘细胞，卵母细胞胞质均匀。 3. C级：卵丘细胞扩散，卵母细胞胞质不均匀。 4. D级：无卵丘细胞的裸卵，细胞质不均匀，且有
➢ 细胞的冷冻保存并不在于能否长期耐受低温，而是在于冷冻和解冻时对细胞的致死性作用（致死性温区-50~15℃）
一、胚胎和卵母细胞在低温冷冻保存过程中的受损机制
➢ 在冷冻过程中，冰晶首先在细胞外液中形成，此时冰晶与溶质分离，使细胞外液浓度升高、渗透压增加，细胞内水分渗出产生溶液效应。
➢ 随着温度继续下降，细胞外冰晶不断形成，未冻结部分的溶液浓度增加，细胞内外的渗透压差增大。这时可能发生两种情况：

冷冻保存对卵母细胞影响的研究进展

发育潜力＿。ｉｚ等用数字成像及分析系统和偏３Ｒｅｉ］ｎ
振光显微镜观察到，经传统的慢速冷冻方法冷冻的
卵母细胞在融解过程中纺锤体消失，虽多数可在３ｈ
生的婴儿仅三百多例。卵母细胞体积大只是造成卵
母细胞冷冻困难的重要原因之一。而在冷冻、冻解
山东省计划生育科研所生殖医学中心（５０２董云玲刘永洁２００）综述李娟审校
摘要随着辅助生殖技术的发展，卵母细胞的冷冻技术受到了广泛关注并被广泛应用。但与早期胚胎的冷人
冻保存相比，卵母细胞的冷冻保存具有复苏后成活率低、精率低、胎发育潜力差、受胚妊娠率低、产率高等特点。冷流冻和解冻过程以及冷冻保护剂等均会对卵母细胞造成一系列形态学、细胞学以及生理、化方面的影响。如：冻保生冷护剂、冻融过程等可对卵母细胞的纺锤体、细胞骨架、胞内钙离子、白质组、胞代谢以及卵母细胞的活性和发育细蛋细潜力造成不同程度的影响。研究卵母细胞特殊的生物学特性以及冷冻对其造成的影响，助于改进卵母细胞的冷冻有
冻存以避免卵子浪费。该项技术还可为卵子赠送提供方便。自１８９６年Ｃｅｈｎ等首次报道冻融人卵母细胞获成功妊娠已二十余年，这项技术进展缓慢，出

玻璃化冷冻卵母细胞及卵巢组织研究进展

词】卵母细胞；卵巢组织；玻璃化冷冻；冷冻保护剂；冻存
Ｐｒｏｇｒｅｓｓ
Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ
ＧＡ０Ｊｉｎｇ，ＣＡ，Ｘｉａ．ＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅＣｅｎｔｅｒ，ｔｈｅＦｉｒｓｔＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＧＡ０Ｊｉｎｇ）；Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ矿ＧｙｎａｅｃｏｌｏｇｙａｎｄＯｂｓｔｅｔｒｉｃｓ，ｔｈｅＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＸｉｎｊｉ犹ｇ
细胞［２Ｊ的生存率和胚泡形成率。玻璃化冷冻前预平
但不影响卵子冷冻过程中的脱水，也不影响卵子的再水化．包被的颗粒细胞对ＭⅡ期卵子的冷冻起一定的保护作用。
卵巢组织玻璃化冷冻
衡时间及温度及膜渗透性会影响冷冻效果．寻求各参数的平衡点对获得好的预平衡效果十分必要。
二、玻璃化冷冻保护剂的应用及改进
常用细胞内冷冻保护剂有：ＤＭＳＯ、甘油、丙二醇（ＰＲＯＨ）、ＥＧ等，细胞外冷冻保护剂有蔗糖、海藻糖等。多数学者认为，ＥＧ＋ＤＭＳＯ和大分子糖类是比
冻样本的体积。可更容易玻璃化。近期Ｆｕｊｉｈｉｒａ等［ｓ］研究发现．去除卵丘细胞的冷冻并不影响卵母细胞复苏后的存活率。但可降低其胚胎的发育能力。
Ｐｕｐｐｅｎ．Ｌｉｎｇｈａｍ等对卵丘颗粒细胞研究表明，其不
寻找最适平衡时间也有助于改善冷冻效果。有研究发现，采用逐步平衡法或洗脱法有助于改善冻融后鼠ＧＶ期卵细胞、人ＭⅡ期卵细胞及人３一原核期卵
细胞骨架、膜完整性等的损伤。自玻璃化冷冻鼠胚
胎首次成功后，该技术已广泛应用于卵母细胞和卵巢组织的冷冻。玻璃化冷冻人卵母细胞Ｙｏｏｎ等将体外受精一胚胎移植（ＩＶＦ．ＥＴ）患者
早在１９７３年。Ｌｕｙｅｔ就证实液体的凝同可分为两种形式：一种是晶体化，液体中的分子呈有序排列；另一种为非晶体化即玻璃化，液体中的分子呈无序排列．保持未凝同前的状态。玻璃态介于液体

胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术

常用的冷冻保护剂包括二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇、丙二醇等。这些物质可以渗透到细胞内，降低细胞内的冰点，从而减少冰晶的形成。
在使用冷冻保护剂时，需要严格控制浓度和暴露时间，以避免对细胞造成毒性和其他不良影响。
冷冻和融化过程
冷冻过程是在极低温度下将胚胎或卵母细胞快速冷却到玻璃态的过程。在这个过程中，细胞内的水分子被固定在玻璃态中，形成一种类似玻璃的结构，从而
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温度变化引起的渗透压变化
在冷冻和复苏过程中，温度的快速变化可能引起细胞内外的渗透压变化，导致细胞损伤。
前景展望
新型冷冻保护剂的开发
随着科学技术的发展，新型的、对细胞毒性更小的冷冻保护剂正在被不断开发出来，这将有助于提高细胞的存活率和功能。
3D打印技术的结合
3D打印技术可以用于制造具有复杂结构的生物材料，这些生物材料可以用于模拟细胞生长的三维环境，提高细胞的存活率和功能。
• 步骤：玻璃化冷冻法包括预处理、玻璃化、解玻璃化和复苏等步骤。预处理阶段与慢速冷冻法相似；玻璃化阶段会快速将细胞降至-196°C；解玻璃化阶段会快速升温至适宜温度；复苏阶段同样进行恢复培养。
• 优点：玻璃化冷冻法降温速度快，避免了冰晶形成对细胞的损伤，因此能够提高胚胎及卵母细胞的存活率。
• 缺点：玻璃化冷冻法操作难度较大，需要使用特殊的设备和试剂，成本较高，且仍存在一定的细胞损伤和突变风险。
卵母细胞冷冻保存
总结词
卵母细胞冷冻保存技术是一种新兴的生殖技术，通过低温保存卵母细胞，延长其存活时间，为女性生育力的保存提供了可能。
VS
详细描述
随着辅助生殖技术的发展，越来越多的女性选择通过卵母细胞冷冻保存技术来保存自己的生育力。这种技术通过将卵母细胞置于低温下，使其进入休眠状态，以便在未来需要时进行复苏和受精。这种技术为女性提供了更多的生育选择和机会，尤其适用于那些需要进行化疗等治疗的女性患者。

卵母细胞的冷冻技术讲解

研究发现包裹卵母细胞的卵丘细胞层数越多，解冻后卵母细胞存活率越高。Jack等比较冷冻GV期卵母细胞前后变化，发现致密的COC与裸卵相比具有较高的成熟率。可能是卵丘细胞参与了卵母细胞的成熟，如果去除卵丘细胞，成熟率则会大幅度降低。
三、实验
⑴冷冻方法与保护剂对牛卵母细胞解冻后细胞发育的影响
1.卵母细胞的采集与成熟培养
三、实验
3.卵母细胞解冻：
将含有卵母细胞部分直接浸入置于恒温台上的含有牛卵母细胞冷冻保存与体外孤雌培养技术研究 0.25mol／L蔗糖解冻液的表面皿中，溶解后将卵母细胞用口吸管轻轻吹出并摇动混in，以充分脱出卵母细胞内部抗冻剂。
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.3卵母细胞成熟阶段
不成熟的卵母细胞在冷冻，解冻后受精率和卵裂率都较低。未成熟卵母细胞的成熟率和受精率要比成熟的卵母细胞的成熟率和受精率低很多，冷冻损伤对成熟的卵母细胞的影响更小。成熟卵母细胞比未成熟卵母细胞对冷冻的耐受性高。
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.4 卵丘细胞的影响
一、冷冻技术概述
1.2冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两种
①渗透性冷冻保护剂主要有丙二醇（PROH）、二
甲基亚砜（DMSO)、甘油和乙二醇(EG)等。
渗透性冷冻保护剂主要通过细胞膜，降低溶液的冰点，增加溶液的粘性，稀释溶液中的溶质浓度。
一、冷冻技术概述
②非渗透性冷冻保护剂主要有蔗糖、葡萄糖和脂蛋白等。
非渗透性冷冻保护剂不能透过细胞膜，但可以增加细胞外溶质浓度，在细胞膜内外形成渗透梯度，吸引细胞内水分外流，使细胞脱水。
各种冷冻保护剂都各有千秋，需要按一定比例混合使用，以加强效果。冷冻保护剂的浓度很重要，它决定了细胞脱水的速率。

动物繁殖复试常见考题

1、17β-雌二醇（E2）根据其化学性质为类固醇激素( )2、原始卵泡内的卵母细胞为初级卵母细胞( )3、GnRH根据其化学性质为类固醇激素( )4、PRL根据其化学性质为蛋白质或多肽类激素( )5、母体妊娠识别时间一般发生在周期黄体消失时间之前( )6、用于人工授精的鲜精活力一般要达到0.3 ( )7、兔是诱发性排卵或刺激性排卵动物( )8、经顶体反应的精子，通过释放顶体素等酶将透明带溶出一条通道而穿越透明带并和卵黄膜接触( )9、前列腺素根据其化学性质为脂肪酸激素( )10、带状胎盘又称内皮绒毛膜胎盘( )11、胎位是指胎儿背部与母体背部或腹部的关系( )12、猫是自发性排卵动物( )13、输精部位与受胎率有关，牛的输精部位应为子宫颈深部( )14、精子尾部原生质滴后移、脱落是精子成熟的主要形态变化( )15、eCG 根据其化学性质为蛋白质或多肽类激素( )16、GnRH根据其化学性质为脂肪酸类激素( )17、马是季节性单次发情的动物( )18、牛、羊和猪成熟卵泡排出的卵子是次级卵母细胞( )19、成熟卵泡内的卵母细胞通常为初级卵母细胞( )20、有腔卵泡内的卵母细胞为次级卵母细胞( )21、兔是自发性排卵动物( )22、弥散型胎盘也称上皮绒毛膜与结缔组织混合型胎盘( )23、前置又称先露，是指胎儿先进入产道的部分( )24、类固醇激素（疏水激素）的受体位于细胞质，通常称细胞质受体( )25、胎向是指胎儿纵轴与母体身体纵轴之间的关系( )26、蛋白质或多肽类激素（亲水激素）的受体位于细胞膜，通常称细胞膜受体( )27、输精部位与受胎率有关，兔的输精部位应为阴道深部( )28、精子的活力是指活精子的百分率( )29、eCG主要由马属动物胎盘的尿囊绒毛膜细胞产生( )30、HCG根据其化学性质为蛋白质或多肽类激素( )31、三级卵泡内的卵母细胞为初级卵母细胞( )32、马是季节性多次发情的动物( )33、无腔卵泡又称腔前卵泡是指原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡( )34、牛是阴道射精型动物( )35、多精子受精可能由2个或2个以上的精子几乎同时进入卵子，又称超数精子( )36、有腔卵泡是指三级卵泡和成熟卵泡( )37、初级卵泡内的卵母细胞为初级卵母细胞( )38、卵巢、胎盘和肾上腺均能分泌E2( )39、弥散型胎盘又称上皮绒毛膜胎盘( )40、透明带的出现是在成熟卵泡时期 ( )41、输精部位与受胎率有关，猪、马子宫体内输精为好( )42、精子的活力是指精液中呈前进运动精子所占的百分率( )43、FSH、LH在精子和卵子发生中均起到重要作用( )44、HCG主要由人和灵长类动物妊娠早期胎盘绒毛膜细胞分泌( )45、山羊是阴道射精型动物( )46、马是具有特定排卵部位“排卵窝”的动物( )47、牛是诱发性排卵或刺激性排卵动物( )48、孕酮（P4）根据其化学性质为类固醇激素( )49、卵泡的发育和排卵主要受FSH和LH控制( )50、垂体促性腺激素和胎盘激素按化学性质都属于蛋白质或多肽类激素( )51、透明带的出现是在初级卵泡时期( )52、绵羊是季节性单次发情的动物( )53、雄性动物的副性腺是指精囊腺、前列腺和尿道球腺，在猪尿道球腺尤为发达不( )54、输卵管的壶腹部通常是卵子受精的地方( )55、睾酮根据其化学性质为类固醇激素( )56、精子的头主要由细胞核构成，内含遗传物质DNA( )57、FSH根据其化学性质为蛋白质或多肽类激素( )58、HMG根据其化学性质为蛋白质或多肽类激素( )59、山羊是诱发性排卵或刺激性排卵动物( )60、马是诱发性排卵或刺激性排卵动物( )61、双侧性隐睾的动物丧失性欲和生殖能力( )62、牛是自发性排卵动物( )63、卵子受精通常在输卵管的峡部( )64、抑制素根据其化学性质为蛋白质或多肽类激素( )65、透明带的出现是在次级卵泡时期( )67、绵羊是季节性多次发情的动物( )68、睾丸间质细胞分泌的雄激素对性欲、第二性征的维持及精子的发生有着重要作用( )69、精子的尾是精子代谢和运动器官( )70、雌激素大量分泌对LH呈正反馈作用( )71、FSH根据其化学性质为蛋白质或多肽类激素( )72、LH根据其化学性质为蛋白质或多肽类激素( )73、山羊是自发性排卵动物( )74、马是子宫射精型动物( )75、双侧隐睾的动物一般没有生育能力但具有正常的性欲( )76、次级卵泡内的卵母细胞为初级卵母细胞( )77、抑制素能抑制垂体FSH的合成与分泌，并能干扰FSH与其受体的结合( )78、骆驼是诱发性排卵或刺激性排卵动物( )79、透明带的出现是在三级卵泡时期 ( )80、猪是子宫射精型动物( )81、盘状胎盘又称血绒毛膜胎盘( )82、绵羊是阴道射精型动物( )83、睾丸支持细胞能分泌雄激素结合蛋白、抑制素和雌激素( )84、精子的运动器官是精子的头部( )85、FSH根据其化学性质为蛋白质或多肽类激素( )86、OXT是由垂体后叶合成和释放的( )87、马是自发性排卵动物( )89、抑制素主动或被动免疫山羊或绵羊能提高排卵率( )90、狗是季节性单次发情的动物( )91、受精过程中顶体释放透明质酸酶可使精子通过放射冠( )92、胚胎附植的部位一般是位于子宫系膜对侧( )93、骆驼是自发性排卵动物( )94、透明带的出现是在原始卵泡时期 ( )95、猪是自发性排卵动物( )96、绵羊是诱发性排卵或刺激性排卵动物( )97、催产素（OXT）是由下丘脑视上核和室旁核内合成，并由垂体后叶贮存和释放( )98、精子和卵子的产生均是连续不断而衡定的( )99、GnRH根据其化学性质为蛋白质或多肽类激素( )100、PMSG根据其化学性质为蛋白质或多肽类激素( )101、大量的E2对FSH的分泌起一种负反馈作用( )102、子叶型胎盘又称结缔绒毛膜胎盘( )103、马成熟卵泡排出卵子的卵周隙通常没有极体，因此，该卵子应为初级卵母细胞( ) 104、水貂是自发性排卵动物( )105、用以人工授精的冻精活力一般要求达到0.3( )106、兔是阴道射精型动物( )107、受精过程中顶体释放透明质酸酶可使精子通过透明带( )108、胚胎附植的部位一般是位于子宫系膜一侧( )109、获能的精子才具备受精能力( )111、绵羊是诱发性排卵或刺激性排卵动物( )112、精子获能可在同种或异种母畜生殖道内，也可在体外培养液中( )1、子叶型胎盘2、血睾屏障3、体细胞克隆4、卵泡囊肿5、妊娠的建立6、玻璃化冷冻7、胎儿产出期8、胚胎分割9、恶露10、黄体囊肿11、精子的存活时间12、不育13、发情周期14、同期发情15、自发性排卵（并举例）16、血绒毛膜胎盘17、卵子的发生18、妊娠的识别19、胎儿胎盘20、胚胎克隆21、精子的发生22、精子获能23、不孕24、乏情25、纵向26、弥散型胎盘27、软产道28、胎膜29、胚胎冷冻保存30、透明带反应31、基因转移32、隐睾33、精子的活力34、内皮绒毛膜胎盘35、外源呼吸36、侧位37、放射冠38、胎盘39、胚胎移植40、桑椹胚41、流产42、硬产道43、激素的半衰期44、上皮绒毛膜胎盘45、内源呼吸46、皮质反应47、产力48、物理伤害49、结缔绒毛膜胎盘50、胎位51、诱发发情52、流产率53、横向54、上位55、下位56、化学伤害57、前置58、胎向59、诱发性排卵（并举例）60、屡配不孕61、超数排卵62、精细管上皮波63、囊胚腔64、子宫复原65、生殖激素66、先露67、次要生殖激素68、卵黄膜反应69、环状胎盘70、胎衣排出期71、情期受胎率72、盘状胎盘73、精细管上皮周期74、人工授精75、子宫颈开口期76、体外受精77、卵裂78、性行为链，也称性行为序列79、顶体反应80、胚盘81、黄体82、精子存活指数83、母体胎盘1、一个初级精母细胞经过两次减数分裂可形成个精子。

山羊卵母细胞冷冻保存技术研究

ｆｅｉｇｍｅｈｄ，ｎＧＶｏｙｅｓｔｅｍａｕａｉａｅｗａ．％，９．ｒｅｚｎｔｏｉｏｃｔ，ｈｔｒｔｏｎｒｔｓ２０５２９％ｒｓｅｔｅｌ，ｈｅｒｌａｉｎｒｔｅｐｃｉｙｔｅｆｔｉｔａｅｖｉｚｏ
ｗａ．％，．％ｒｓｅｔｅｙｉｏ￣ｅｆ，ｈｔｒｔｎｒｔｓ２．％，２０ｒｓｅｔｅｙＴｅｓ６３９１ｅｐｃｉｌ；ｎｏｃｓｏｈｔｅｍａｕａｉｅｗａ０５３．％，ｅｐｃｉｌ．ｈｖ９ｏａｖ
ｆ｝ｉａｉａｅｗａｓ５．％，１７％，ｅｐｃｉｅｙｎｌｅｒｌｔｔｉｏｎｒｔｚ１０＿ｒｓｅｔｌ；ＩＶＭｃｔｓ，ｈｅｉｚｔａｅｗａｓ２１４％，０．ｖｏｏｙｅｔｅｆｒｌａｉｒｔｔｉｏｎ．３３％，
中图分类号：￥２．５８７３文献标志码：Ａ文章编号：１０ — ３９２１）９００ — ６０５９６（０２０ — ０００
ＳｔｄｎｃｙｐｅｅｖｔｎｔｃｎｏｙｏｏｔｏｃｔｓｘａｎｇＨＡＧｕｙｏｒｏｒｓｒａｉｅｈｏｌｇｆｇａｏｙｅ／ｕＤｎｉ，ＵＮｏｎ
收稿日期：２１－２２０１１－０
基金项目：农业部公益性行业（奶山羊）科研专项（０１３３）２１００８作者简介：许丹宁（９８）１７一，女，副教授，博士，研究方向为动物营养及生殖生理。Ｅｍｉｘａｎｎ＠１６ｃｒ — ａｌｄｎｉｇ２．ｏ：ｎ通讯作者：田允波，教授，博士生导师，研究方向为动物生殖生理及繁殖生物技术。Ｅｍｉｔｎｏ２．ｏ — ａ：ｕｂ＠１６ｃｒ］ｙｎ

OPS法玻璃化冷冻山羊卵母细胞的研究

维普资讯
兽医通讯》２０上０６年第１期
ＯＰＳ法玻璃化冷冻山羊卵母细胞的研究
周俊波戴荣亮王杏龙 ’ （扬州大学动物科学与技术学院江苏扬州２５０２０９）
卵母细胞，它们之间差异显著（＜００）Ｐ，５。
关键词：Ｐ；璃化；ＯＳ玻卵母细胞；羊山目前，随着胚胎生物技术的日新月异，冻技术也快速冷
１４卵母细胞的冷冻．
将培养液、冻液在３ ℃ 水浴锅内预热，后往在加热冷９然台上预热的４孔培养皿中的１２３４号孔里依次加人：０、、、８０ＨＭ、０ｌ８０ＨＭ、０ｌ１和１０ｌ２１００ＩＶＳ０ｌ。将待冷０ＶＳ
于ｖｓ而不同期的卵母细胞对于冷冻后的发育能力有明显的影响，ｎ；无论是ＶｓＩ还是ＶＳⅡ，Ｖ期和培养１Ｇ０ｈ卵
母细胞的形态正常率、熟率、精率差异不显著（＞００）但Ｇ期和培养ｉ成受Ｐ．５，Ｖ０ｈ卵母细胞受精率均低于ＩＶＭ期
０８ｍｍ。然后把细管从中间再割成两截，以获得２根等．可长的ＯＳＰ。制好后的ＯＳ在用前２ｄ用７％酒精浸泡过夜ＰＯ消毒，然后倒去酒精，ＯＳ自然干燥后待用。让Ｐ
涤两次，观察卵母细胞解冻后形态完好情况，计算解冻后卵母细胞形态正常率。

人类成熟卵母细胞玻璃化冷冻研究

玻璃化冷冻研究
邢琼曹云霞章志国魏兆莲周平赵济华
摘要目的：研究人类成熟卵母细胞玻璃化的方法和冷冻液，探讨人类卵母细胞玻璃化冷冻保存的方法及临
床应用价值。方法：运用ｃｏａ进行人类成熟卵母细胞玻璃化冷冻保存。ｒｌｆｙｅ复苏后行胞浆内单精子注射一胚胎移植或培养至囊胚形成，观察复苏后卵母细胞受精及发育能力。根据冷冻方法分为程序化冷冻组和玻璃化冷冻组。又将玻璃化冷冻组分为自配液冷冻组和成品液冷冻组，比较各组存活率、受精率、卵裂率及囊胚形成率。结果：程序化冷冻组和
ｗｒｙｐｅｅｖｄｕｉｇｒｏａ．ｅｕｃａｄｏｃｔｓｅｅｄｉｉｅｅｙｎａｙｏｌｍｃｐｒｉｅｔｎＯｓ）ｅｂｙｅｅｒｏｒｓｒｓｙｌｆＲｓｓｉｔｏｙｅｒｍｎｓｒｄｔｅｔｐｉｓｅｍｊｃｏｃＩｍｒｅｅｎｃｅｔｅｗａｔｂｉｒｓａｎｉ，ｏ
ａｄｔｖｓｇｔｅｆａｉｉｔｎｌｉａｐｌａｉｎｖｌｅｏｏｙｅｒｏｒｓｒａｉｎＭｅｈｏｓＨｕｎｔｒｏｙｅｎｉｅｔａｅｔｓｌｙａｄｃｎｃｌａｐｃｔａｕｆｃｔｓｃｙｐｅｅｖｔ．ｏｎｉｈｅｂｉｉｉｏＯｏｔｄ：ｍａｍａｕｅｏｃｔｓ
ｔｎｐａｔｔｎｏｕｔｒｄｔｌｓｌｔｎｏｓｒｉｇｔｅｆｒｌａｉｎａｄｄｖｌｐｎａａａｉｆｏｙｅ．ｈｏｙｅｒｒｓｌｎａｏｒｃｌｅｂａｔａｉ，ｂｅｖｎｅｔｉｔｎｅｅｏｍｅｔｌｃｐｃｔｏｃｔｓＴｅｏｃｔｓｗｅｅａｉｕｏｕｏｈｉｚｏｙｏ

OPS

ＣｉａＡｇｉｕｔｒｌＵｎｖｒｉｈｎｒｃｌｕａｉｅｓｔｙ，Ｂｉｉｇ１０９ｅｎ００４）ｊ
ＡｂｓｒｔＢｏｉｅｏｙｅｕｔｅｉｔｏｏｒ６ｈｏ２ｈｗｅｅｒｓｅｔｖｌｔｉｉｄｉｔａｃ：ｖｎｏｃｔｓｃｌｕｒｄｎｖｉｒｆｒ２ｒｅｐｃｉｅｙｖｉｒｆｅｎＥＦＳ４０，ＥＦＳ０，５
＞０．０５）．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＯＰＳ；Ｖｉｒｆｃｔｏｔｉｉａｉｎ；Ｏｏｙｔｏｖｉｅｃｅ；Ｂｎ
哺乳动物卵母细胞的有效冷冻保存是保护品种资源和拯救濒危动物不可缺少的技术保障之一，是加快家畜品种改良和胚胎移植技术产业化ｂｗｏｓｅｔｏｔＳ（ｐｎｐｌｄｓｒｗ）３ｎ４ｙｔ —ｔｐｍｅｈｄｗｉｈＯＰｏｅｕｌｔａ．Ｔｈｅｔｒｓｌｒｒｍｏｙｅｅｅｂｓｅｕｔｗｅｅｆｏｏｃｔｓｓ
成部分。同时也是为克隆、基因动物生产和显微转
存的水平。Ｎａａａａ２采用ＤＯ、ｋｇｔＭＳ乙酰胺为主体抗冻保护剂制成玻璃化溶液（１冷冻小鼠成熟卵ＶＳ）母细胞，冻后形态正常率达８％，形态正常的解７将卵母细胞进行体外受精，裂率达７％，后未能卵８此继续发育。Ｍｉａｅ等ｌ一细乙二醇为主体的抗冻ｙｋ３用液对小鼠卵母细胞冷冻保存，冻后形态正常率仅解为４％。而后Ｐｄｏ等用ＤＯ代替乙二醇冷冻ｅｒＭＳ后小鼠卵母细胞形态正常率达４％，裂率也很２卵低。在家畜方面，ｕｕ等一丙二醇为主体抗冻Ｆｋ５以剂，慢速冷冻法对牛成熟卵母细胞冷冻保存，冻用解

玻璃化冷冻法

玻璃化冷冻法慢速冷冻法即玻璃化冷冻来自于自然的启示，科学家发现某些种类的青蛙可在冬季经历零下数十度冷冻，而在春季解冻，且机体没有任何损伤。

研究认识到，这种青蛙冷冻时体内存在丙三醇，代替水作为细胞内溶剂，而在春天苏醒后体内丙三醇消失。

“玻璃化”的概念是指水或溶液快速降温达到或低于-100℃~-110℃的温度范围时，形成一种高黏度的介于液态和固态之间、非晶体的、透明的玻璃态。

玻璃化冷冻技术的基本原理就是用高浓度的冷冻保护剂溶液将细胞内水分置换出来，经急速降温由液态转化为外形似玻璃状的非晶体化固体状态。

1985年，玻璃化冷冻鼠胚胎首先获得成功。

目前，玻璃化冷冻保存细胞已成功应用于动物卵母细胞、血细胞及胚胎，眼角膜、皮肤、血管等组织中，而人类胚胎中的应用始于1990年，目前已经获得广泛成功。

玻璃化冷冻技术是快速冷冻与高浓度冷冻保护剂相结合的结果。

快速冷却，低温时形成透明的玻璃状固体，冷却过程中黏度很高，但无冰晶形成，避免冰晶形成对细胞脂质膜及细胞骨架结构的损伤，保留细胞内外液体正常的分子和离子分布。

玻璃化冷冻主要操作步骤简单，包括：高浓度的冷冻保护剂置换细胞内外的溶液，快速降温，使溶液黏稠度极度提高并固化，放置液氮保存。

影响玻璃化冷冻效果的因素主要包括：①冷冻保护剂。

同一种组织细胞，冷冻保护剂的浓度和种类是最重要的一个影响因素。

细胞外冷冻保护剂一般采用大分子物质，如多糖类(蔗糖、海藻糖)、聚乙二醇、胎牛血清白蛋白(BSA)和Percoll 等；细胞内冷冻保护剂为具有良好穿透性的小分子物质，如二甲基亚砜、乙二醇和丙二醇。

冷冻保护剂毒性也是人们对玻璃化冷冻担心的主要问题，但迄今大量的临床和动物实验均未发现这些冷冻保存剂对动物和人类胚胎有任何不良影响；②温度下降速度。

降温速度越快越好，可直接沁入液氮的方法，降温速度约为2500 ℃/min，而使用玻璃化冷冻仪降温速度可达135000 ℃/min；③胚胎载体。

对胚胎载体的要求是胚胎周围的冷冻保存剂体积应尽量小，与液氮间隔尽量少，操作简便且不易丢失胚胎，目前常用的有：拉细的麦管、Cryotop、Cryotip、Cryoleaf、直接微滴法、电镜网和Cryoloop。

卵巢玻璃化冷冻保存研究进展

保护剂（ｒｏｒｔｃｉｅａｅｔＣＡ）合极快的制ｃｙｐｏｅｔｇｎ，Ｐ结ｖ
冷速度，细胞内液体形成玻璃化状态以避免细胞使内外冰晶的形成。此方法的优点是无需特殊冷冻仪
种冷冻保存的新方法。随着近年来对于人类生殖能器，冷冻过程时间短，胞内冰晶形成少，械性损细机Ｐ其力的保存越来越受到重视，冻保存技术已成为人伤少。但由于玻璃化冷冻需高浓度的ＣＡ，细胞冷们所关注的一个焦点ｌ。２０１０３年，国受癌症折磨毒性和渗透性损伤较大，卵巢组织有一定的损伤］美对３］的妇女超过６０５００人，中相当一部分人处于生育作用［。卵巢组织冷冻复苏后初级卵泡的正常形态其年龄【。对于青少年患者来说，存植入前胚胎几率明显低于原始卵泡，明冷冻复温对初级卵泡的２］冻说乎是不可能的；存成熟和未成熟卵母细胞也有许损伤大于原始卵泡，能与初级卵泡较原始卵泡代冻可多技术上的难题，而并不能保证生育；巢组织的冻谢率高，冷冻降温敏感的颗粒细胞增多、大，卵对增冻４］存与移植是将来解决癌始前妇女症患者生育能力保存时易发生冷冻损伤有关［。存最有希望的方法［。２］突然死亡的珍稀物种或稀有突变体动物的卵巢予以获得该物种。卵巢组织冷冻保存技术在保持生物多

卵母细胞冷冻保存的方法

卵母细胞冷冻保存的方法（一）卵母细胞的获取随着哺乳动物胚胎操作技术的成熟和胚胎移植技术商业化的迅猛发展，各领域对卵母细胞的需求量与日俱增。

单纯依赖超数排卵获取卵母细胞的方法费用高、对动物生理功能影响大且获得的数量有限，因此不能满足科学研究和生产的需求。

现在主要有两种获取卵母细胞的途径：一是从活体卵巢采集，二是从屠宰厂废弃卵巢中获取卵母细胞。

1.活体卵巢上采集（1）腹腔镜法：此法在手术部先行局部麻醉，以消毒导管针刺入腹腔并向腹腔内轻轻打气、压迫胃肠前移，从导管内插入内镜进行搜索观察。

另用套有聚四氟乙烯套管的吸卵针在内镜引导下刺入卵泡内吸取卵母细胞。

该法在牛上采集排卵前卵母细胞可达80%～90%回收率。

（2）B型超声波法：此法将带有超声波探头和采卵针的采卵器插入到保定和麻醉母畜阴道子宫颈的一侧弯隆处缓慢移动卵巢，用吸卵针刺入直径大于2mm的卵泡，真空吸入卵母细胞和卵泡液。

现在，此法已成为牛活体采卵的主要方法。

（3）活体输卵管采卵法：通过手术方法采集排入输卵管内的卵母细胞。

打开腹部后，找到子宫角和输卵管并牵出腹腔外，自宫管接合部插入注射针、逆向从伞部输卵管腹腔孔冲洗，或者在宫管接合部子宫角尖下1cm处插入接卵管接于平皿中，自伞部输卵管腹腔口顺向注入冲卵液。

该方法目前是猪、绵羊、山羊、兔等动物常用的活体采卵方法。

2.屠宰后卵巢上采集动物屠宰后立即无菌采集卵巢，放入30～39℃灭菌生理盐水或灭菌PBS中，6小时内带回实验室。

尽管有人认为在18～21℃收集和操作牛卵母细胞能提高卵母细胞成熟率，Yang等（1990）的研究结果表明，牛卵巢在24℃保存24小时后收集的卵母细胞体外受精后仍有71.2%的卵裂率，而Solano等1994年的研究更显示将牛卵巢在4℃放置12～24小时后其卵裂率不受任何影响。

卵巢表面卵泡卵母细胞的获得是目前体外成熟培养中卵母细胞的主要来源，其采集方法有如下3种。

（1）抽吸法：用配以16号或18号针头的5ml或10ml注射器从直径2～6mm的卵泡中抽吸卵泡液。

玻璃化冷冻度

玻璃化冷冻液为VSI ( TCM199+HEPES+10%FCS+ 10%DMSO + l0%EG)和VSⅡ(TCM199+HEPES+20%FCS+20%DMSO+20%EG+0.5MSUCROSE)。

各种冷冻保护剂均具有保护作用，但效果不一样，甘油的效果较差，EG相对较好。

人卵母细胞在室温放置30 min，纺锤体就完全解聚，复温后仅25%一50%可恢复纺锤体结构，牛体外成熟卵母细胞在4℃保持10-20 min，纺锤体可完全解聚，而猪卵母细胞在4℃仅5 min，就会发生部分或完全解聚。

玻璃化冷冻和解冻冷冻：室温下将卵子在PBS+20％FCS(S)中冲洗2～3次后移入10％乙二醇(EG)+10％二甲基亚砜(DMSO)中停留30 s，然后移入20％EG十20％DMSO+0．5 mol／L糖中，用细麦管通过虹吸作用将卵吸入管中，投入液氮。

解冻：在室温下依次将卵子移入含0．4 mol／L糖、0．2 mol／I．糖、0．1 mol／L糖的S及s中，各停留3 min，再于37。

C中停留5 min，最后移入MEM中，准备体外培养成熟(IVM)当进人渗透压梯度较大的高渗溶液时，卵母细胞和卵丘细胞都大幅度收缩，造成二者牵拉、损伤，破坏了胞间连接。

比较了DPBS和TCM199对冷冻保护效果的影响，试验结果表明，二者在冷冻保护效果上无显著差异。

冷冻损伤包括两个因素:一是胞内冰晶造成的机械损伤;二是细胞在高浓度冷冻保护液中暴露时间过长造成的溶质损伤。

这些损伤的发生多在15℃和一5℃间的温度范围。

玻璃化冷冻胚胎的处理过程是影响玻璃化冷冻效果的重要因素。

冷冻前，先用预热到37 ℃, 1 M的DMSO预先处理胚胎5 min，可以使保护剂充分渗透到细胞内，并且因为保护剂浓度较低所以对胚胎产生的毒性作用小。

玻璃化溶液使用DAP213 (DMSO+丙二醇+乙酞胺)，其中DMSO为主要低温保护剂，促进渗透;丙二醇强化玻璃化形成能力;乙酞胺是毒性中和剂，降低了毒性作用。

冷冻保存能降低绵羊卵母细胞受精能力

冷冻保存能降低绵羊卵母细胞受精能力田树军;孙树春;闫长亮;朱士恩;杨慧欣【期刊名称】《中国兽医学报》【年(卷),期】2008(28)10【摘要】本实验研究了体外成熟绵羊卵母细胞在含抗冻保护剂DMSO和EG的冷冻液中暴露和OPS法玻璃化冷冻保存后对体外受精卵裂率、精子入卵率、皮质颗粒分布、酶溶解透明带时间及雌原核形成的影响。

将体外成熟24h的绵羊卵母细胞分为3组:(1)对照组,卵母细胞不进行处理;(2)毒性组,卵母细胞在冷冻液中进行暴露但不投入液氮中冷冻;(3)冷冻组,卵母细胞利用OPS法进行玻璃化冷冻。

处理组卵母细胞在浓度递减的蔗糖溶液中脱除抗冻保护剂。

结果,卵母细胞体外受精的卵裂率和单精子入卵率,毒性组(62.3%和29.3%)和冷冻组(67.6%和28.2%)显著低于对照组(78.4%和45.0%)(P<0.05),毒性组和冷冻组间无显著差异(P>0.05)。

为了研究冷冻保存导致卵母细胞受精能力降低的机制,处理组及对照组一部份卵母细胞分别于处理后0h(IVM24h)、2h(IVM26h)和体外受精后12h(IVF12h)测定皮质颗粒分布和用0.1%链霉蛋白酶溶解透明带时间,另一部份卵母细胞则在不含有精子的受精液中孵育12h后测定雌原核形成率。

结果,在IVM24h和IVM26h,皮质颗粒呈完全释放的比例,毒性组(41.2%和40.8%)和冷冻组(41.7%和51.8%)显著性高于对照组(7.1%和18.4%)(P<0.05);IVM26h酶溶解透明带时间,毒性组(435.6±16.6)s和冷冻组(422.3±14.6)s显著长于对照组(381.6±15.3)s(P<0.05);雌原核形成率,毒性组(58.7%)和冷冻组(63.9%)组显著高于对照组(8.2%)(P<0.05)。

上述结果表明,含DMSO和EG的冷冻液对体外成熟绵羊卵母细胞具有孤雌激活作用,引起皮质颗粒的提前释放,导致透明带变硬,降低卵母细胞的受精能力。

奶牛卵母细胞玻璃化冷冻方法及胚胎程序化冷冻研究的开题报告

奶牛卵母细胞玻璃化冷冻方法及胚胎程序化冷冻研
究的开题报告
一、研究背景及意义
近年来，随着生殖技术的逐步发展和成熟，胚胎冷冻技术已经成为
了一种有效的保护和利用动物遗传资源的方法。

同时，该技术也被广泛
应用于人类的生殖医学领域，为不孕不育、遗传疾病等问题提供了可行
的解决方案。

在动物领域，奶牛是重要的经济动物之一，其肉、奶、皮毛等多个
产业都拥有广阔的市场。

而胚胎冷冻技术的应用不仅可以为奶牛的优良
种群提供保护，还可以实现对其生产效益的提高。

因此，奶牛胚胎冷冻
技术的研究具有重要的意义和应用价值。

二、研究内容及方法
1. 奶牛卵母细胞玻璃化冷冻方法的研究
卵母细胞玻璃化冷冻是指将卵母细胞置于高浓度保护剂溶液中，使
其渐进性脱水并达到可逆的冷冻/解冻状态，从而实现卵母细胞的保存和
利用。

本研究将对奶牛卵母细胞冷冻的基本条件进行研究，并通过体外
培养和移植实验，测试不同奶牛卵母细胞冷冻方案的效果和适用范围。

2. 奶牛胚胎程序化冷冻技术的研究
程序化冷冻技术是指将胚胎在发育过程中特定阶段静止，并将其置
于保护剂溶液中进行快速冷冻和解冻，以保证胚胎的完整性和发育能力。

本研究将针对奶牛胚胎发育过程中的不同阶段，设计多种具有代表性的
程序化冷冻方案进行研究，并通过移植实验，比较其效果和适用范围。

三、研究预期及意义
通过本研究的开展，可为奶牛胚胎冷冻技术的应用提供更为科学和有效的方法和技术路线，进一步保护和利用奶牛的遗传资源，推动奶牛产业的可持续发展。

同时，该研究在探索动物胚胎冷冻技术的理论和实践方面也将为生殖医学领域的进一步发展提供参考和借鉴。

不成熟卵母细胞的体外成熟培养及玻璃化冷冻

不成熟卵母细胞的体外成熟培养及玻璃化冷冻廖宏庆;林戈;陆长富;卢光琇【期刊名称】《中国现代医学杂志》【年(卷),期】2010(20)11【摘要】目的比较显微授精治疗周期中剩余的生发泡(GV)期不成熟卵母细胞的体外成熟培养及玻璃化冷冻效率.方法将显微授精(ICSI)周期剩余的GV期卵母细胞随机分为3组:①在GV期玻璃化冷冻,解冻后进行体外成熟培养;②体外成熟培养至MII期后行玻璃化冷冻;③对照组:直接进行体外成熟培养(IVM).观察体外培养成熟卵母细胞及不同成熟阶段卵母细胞冷冻后的受精和发育潜力.结果对照组的成熟率为71.6%(53/74),其中16枚行显微授精(ICSI),受精率为87.5%(14/16),卵裂率为85.7%(12/14),囊胚形成率为14.3%(1/7);组1与组2的存活率分别为97.5%(39/40)和87.5%(35/40),差异没有显著性;但是组1的成熟率28.2%(11/39)显著低于(P<0.01)对照组的成熟率71.6%(53/74);组2的受精率74.1%(20/27)与对照组的受精率87.5%(14/16)相比,差异没有显著性.结论 ICSI周期剩余的GV期卵母细胞能在体外培养成熟并具有良好的发育潜力,将GV期卵母细胞体外成熟培养至MⅡ期更适合于玻璃化冷冻保存.【总页数】5页(P1614-1617,1621)【作者】廖宏庆;林戈;陆长富;卢光琇【作者单位】中南大学生殖与干细胞工程研究所,湖南,长沙,410078;中南大学生殖与干细胞工程研究所,湖南,长沙,410078;中南大学生殖与干细胞工程研究所,湖南,长沙,410078;中南大学生殖与干细胞工程研究所,湖南,长沙,410078【正文语种】中文【中图分类】R71;Q2【相关文献】1.保存温度对卵母细胞体外成熟率的影响及牦牛卵母细胞体外成熟培养方式初探[J], 庞礴;赵新全;郭志林;屈雷;于鸿浩;郭松长2.年龄及月经周期时相对不成熟卵母细胞质量及体外成熟的影响 [J], 艾继辉;罗丽兰;刘建新3.人类不成熟卵母细胞体外成熟影响的因素初探 [J], 谢常青;林戈;杨苏安;阳翎;卢光琇4.牛卵母细胞体外成熟,体外受精培养的胚胎玻璃化冷冻试验 [J], Mahm.,AR;皮光辉5.未成熟卵母细胞体外成熟前后玻璃化冷冻的比较 [J], 施丽;公方强;莫毅;牛向丽因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。