【CN109628519A】一种酶法拆分制备N-甲基-D-天冬氨酸的方法【专利】
酶法生产DL-天冬氨酸的方法[发明专利]
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专利名称：酶法生产DL-天冬氨酸的方法专利类型：发明专利
发明人：蒋光玉
申请号：CN201610092960.4
申请日：20160220
公开号：CN105506016A
公开日：
20160420
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种酶法生产DL-天冬氨酸的方法，属于生物工程领域，该方法利用天冬氨酸消旋酶使L-天冬氨酸消旋从而生产DL-天冬氨酸，包括如下步骤：L-天冬氨酸加入碱性物质溶解配成L-天冬氨酸盐水溶液作为酶促反应的底物；向底物溶液中加入天冬氨酸消旋酶，控制反应温度进行酶促反应；反应完成后，过滤，升温加入活性炭脱色，冷却后向清液中加入硫酸调节pH，使DL-天冬氨酸从溶液中结晶析出，冷却后抽虑、洗涤、干燥可得DL-天冬氨酸产品。
本发明生产方法原料易得，生产工艺简单，反应条件温和，降低了DL-天冬氨酸的生产成本。
申请人：蒋光玉
地址：238300 安徽省芜湖市无为县西大街君临·四季花都小区8栋405室
国籍：CN
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一种酶法转化制备D-组氨酸的方法[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810481090.9(22)申请日 2018.05.18(71)申请人 南京大学地址 210023 江苏省南京市栖霞区仙林大道163号(72)发明人 焦庆才 刘均忠 曹双燕 吴婷 余进海 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207代理人 胡锡瑜(51)Int.Cl.C12P 13/24(2006.01)C12P 13/00(2006.01)C12R 1/40(2006.01)C12R 1/01(2006.01)(54)发明名称一种酶法转化制备D-组氨酸的方法(57)摘要本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酶法转化制备D-组氨酸的方法。
该方法以L-组氨酸为底物，加入具有氨基酸消旋酶活性的菌体细胞或粗酶液，经消旋反应得到DL-组氨酸，去除氨基酸消旋酶后，再加入具有组氨酸脱羧酶活性的菌体细胞或粗酶液拆分DL-组氨酸，得到D-组氨酸和组胺，最终利用等电点结晶和离子交换树脂相结合的方法分离得到高品质的D-组氨酸。
该方法以L-组氨酸为底物，双酶级联催化制备D-组氨酸，同时副产高附加值的组胺，具有反应条件温和，绿色环保，操作简便，生产成本低，适合大规模工业化生产等优点。
权利要求书1页 说明书4页CN 108384818 A 2018.08.10C N 108384818A1.一种酶法转化制备D -组氨酸的方法，其特征是由以下步骤构成：(1)将恶臭假单胞菌来源具有氨基酸消旋酶活性的菌株、产气肠杆菌来源具有组氨酸脱羧酶活性的菌株分别在培养基中培养，产生高活力的氨基酸消旋酶、组氨酸脱羧酶；培养基碳源采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和/或乳糖，培养基中总碳源质量浓度为1～20g/L；氮源采用牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨和/或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为1～20g/L；(2)以30～200g/L的L -组氨酸为底物，加入具有氨基酸消旋酶活性的菌体细胞或粗酶液，0.05～0.5g/L的磷酸吡哆醛，20～45℃，用氢氧化钠水溶液控制pH 7～10，酶法消旋，待反应液旋光为零，去除氨基酸消旋酶；反应液中再加入具有组氨酸脱羧酶活性的菌体细胞或粗酶液，盐酸控制pH5～7，25～45℃酶促转化，得到D -组氨酸和组胺；(3)利用等电点结晶和离子交换树脂相结合的方法分离转化产物，得到高纯度的D -组氨酸，同时得到高附加值的组胺。
一种氨基酸生物拆分的新方法[发明专利]
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专利名称：一种氨基酸生物拆分的新方法
专利类型：发明专利
发明人：刘守信,甄小丽,纪德彬,康怀萍,胡素坤,丁文科申请号：CN200710185671.X
申请日：20071229
公开号：CN101186944A
公开日：
20080528
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及生物化工领域，尤其涉及一种DL－N－乙酰氨基酸酯直接生物催化水解拆分制备L－氨基酸和D－氨基酸的新方法。
以DL－N－乙酰化氨基酸酯为底物，以米曲霉菌Aspergillus Oyzae Lb3085发酵获得包含有酰胺水解酶和酯水解酶的酶制剂为催化剂，用去离子水为溶剂于酶催化反应器中使底物中的L－N－乙酰氨基酸酯水解为L－氨基酸，而底物中D－N－乙酰氨基酸酯酸性水解为D－N－乙酰氨基酸，从而实现拆分。
这种“一菌两酶”拆分技术能有效地减少中间操作过程，达到了简捷、清洁的目的。
申请人：河北科技大学
地址：050018 河北省石家庄市裕华东路70号
国籍：CN
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一种酶法拆分制备(R)-1-(1-萘基)乙胺的方法[发明专利]
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专利名称：一种酶法拆分制备(R)-1-(1-萘基)乙胺的方法专利类型：发明专利
发明人：汪斌,贡洁,翁居轼,杨凤丽,陈舟,梁国斌,叶招莲,刘维桥
申请号：CN201811275317.0
申请日：20181030
公开号：CN109234352A
公开日：
20190118
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种化学酶法制备(R)‑1‑(1‑萘基)乙胺的方法，该方法以固体超强碱负载纳米钯，得到固定化钯；环氧树脂载体表面共价结合南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)，得到固定化CALB。
在反应体系A中，以固定化CALB为催化剂，以甲苯为溶剂，乙氧基乙酸乙酯为酰基供体，(R)‑1‑(1‑萘基)乙胺选择性被酯化，反应结束后固液分离，固定化CALB留在反应体系A中，液相从反应系统A中移出进入反应体系B中，该方法将钯催化剂固定化，提高了其重复使用率。
申请人：江苏理工学院
地址：213001 江苏省常州市中吴大道1801号
国籍：CN
代理机构：常州佰业腾飞专利代理事务所(普通合伙)
代理人：高姗
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【CN109628544A】一种脂肪酶在拆分N乙酰DL甲硫氨酸甲酯中的应用【专利】
( 12 )发明专利申请
(21)申请号 201910057292 .5
(22)申请日 2019 .01 .22
(71)申请人 浙江工业大学 地址 310014 浙江省杭州市下城区潮王路 18号
(72)发明人 郑建永 吴鹏 章银军 孙杰 汪钊
(74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限公 司 33201
4 .如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂用量以缓冲液体积计为10g/L，所 述底物终浓度以缓冲液体积计为5-20g/L。
5 .如权利要求3所述的应用，其特征在于反应时间为2-60min。 6 .如权利要求3所述的应用，其特征在于所述反应条件为35℃、800rpm反应10min。 7 .如权利要求3所述的应用，其特征在于所述缓冲液为pH 7 .0、0 .2mM的Na2HPO4/NaH2PO4 缓冲溶液。 8 .如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含脂肪酶编码 基因的工程菌接种在LB培养基中，37℃培养OD600至0 .4-0 .6，加IPTG至终浓度0 .02mM，30℃ 培养10-12h ，菌液8000rpm ，4℃离心10min ，收集菌体 ，再 用PBS缓冲液洗涤菌体2次 ， 8000rpm，4℃离心10min，收集湿菌体，冻干，得到湿菌体冻干粉。 9 .如权利要求1所述的应用，其特征在于所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后， 反应液用4mM HCl酸化至pH 2 .0，然后用等体积乙酸乙酯萃取，分液漏斗分离出有机相，再 经纯水洗涤两次 ，饱和NaCl洗涤两次 ，将洗涤后得到的有机相用无水硫酸镁进行干燥 ，除去 水后，再将有机相旋蒸至干，得到产物N-乙酰-L-甲硫氨酸甲酯。
2 .如权利要求1所述的应用，其特征在于所述脂肪酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示。
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权利要求书1页 说明书3页 序列表1页 附图1页
CN 109628519 A
CN 109628519 A
权 利 要 求 书
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1 .一种酶法拆分制备N-甲基-D-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步 骤：
(1)将Thermomicrobium roseum肌氨酸氧化酶基因构建于pMA5-YwbN-trsox质粒，并转 化Bacillus subtilis WB600细胞中进行分泌性表达；
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CN 109628519 A
说 明 书
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一种酶法拆分制备N-甲基-D-天冬氨酸的方法
技术领域 [0001] 本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及一种酶法拆分制备N-甲基-D-天冬氨 酸的方法。
背景技术 [0002] N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)是动物机体中天然存在的一种氨基酸衍生物，分子式 为C5H9NO4，分子量为147 .13，是哺乳动物中枢神经系统中重要的兴奋性神经递质L-谷氨酸 同系物。NMDA一般仅存在于人和动物的神经和内分泌组织中，参与下丘脑-垂体生长轴的调 控分泌作用，可明显提高细胞内的Ca2+水平，并使cAMP浓度降低；NMDA也可参与神经内分泌 的调节中起重要作用，显著促进动物机体生长激素(GH)的分泌；通过抑制PC12细胞DNA合成 而影响细胞的增殖活性，可用于抗肿瘤药物的合成。能够显著促进动物腺垂体中生长激素、 黄垂体生成素、促性腺激素释放以及催乳素的分泌，是一种高效促生长的新型饲料添加剂。 目前，NMDA已被开发作为一种新的功能性食品添加剂。 [0003] 目前，N-甲基-D-天冬氨酸主要以化学法合成。其中，蒋光玉等人的论文(精细与专 用化学品，2011 ,19(1):45-48)中采用了直接甲基化方法，以D-天冬氨酸为原料，经酯化反 应合成D-天冬氨酸二甲 酯盐酸盐 ，D-天冬氨酸二甲 酯盐酸盐在DMF溶剂中 与碘甲 烷反应生 产N-甲基-D-天冬氨二甲酯，进一步在碱性条件下水解生成N-甲基-D-天冬氨酸。该方法反 应步骤较多，且产品不易分离。此后，蒋光玉等人的专利(CN201110427732 .5)中采用还原胺 法 ，以 D-天冬氨酸为原料 ，过量多聚甲 醛 、以 及还原剂 (氰基 硼氢化钠) 在甲醇溶剂中反应 ， 得到N-甲基-D-天冬氨酸。朱高峰等人的论文(化学试剂，2016 ,38(3) ,280-283)中采用了以 D-天冬氨酸为原料 ，依次通过酯化、酰化 、N-甲 基化 和水解四步反应 制得目 标化合物。化学 法合成N-甲基-D-天冬氨酸主要存在步骤较多、操作复杂、试剂毒性较大等缺陷。在黄建坡 等人的专利(201210130205 .2)中，利用一种能够表达N-甲基-L-天冬氨酸-β-脱羧酶的假单 胞菌，特异性的将N-甲基-L-天冬氨酸转化为N-甲基-L-丙氨酸，从而完成N-甲基-D-天冬氨 酸的手性拆分。但假单胞菌存在潜在的致病性。 [0004] 以上研究均存在一定的缺陷，为此，有必要开拓思路，寻找更为高效稳定的提取方 法。
( 19 )中华人民 共和国国家知识产权局
( 12 )发明专利申请
(21)申请号 201910030583 .5
(22)申请日 2019 .01 .14
(71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大 道1800号
(72)发明人 辛瑜 张梁 张瑶 高秋月
(74)专利代理机构 无锡华源专利商标事务所 (普通合伙) 32228
本发明公开了一种酶法拆分制备N-甲基-D天冬氨酸的方法，所述方法包括如下步骤：(1 )将 Thermomicrobium roseum肌氨酸氧化酶基因构 建于pMA5-YwbN-trsox质粒 ，并转化Bacillus subtilis WB600细胞中进行分泌性表达；( 2 )将 转 入 pM A5-Yw bN- trs o x基因 质粒的 Ba cill us subtilis WB600细胞进行发酵，获得的培养液上 清与N-甲基-DL-天冬氨酸溶液混合 ，针对N-甲 基-L-天冬氨酸进行具有手性选择性的生物催 化；( 3 )采用等电点结晶法分离得到N-甲基-D天 冬氨酸。
代理人 聂启新
(51)Int .Cl . C12P 13/20(2006 .01) C12P 41/00(2006 .01)
(10)申请公布号 CN 109628519 A (43)申请公布日 2019.04.16
( 54 )发明 名称 一种酶法拆分制备N-甲基-D-天冬氨酸的方
法 ( 57 )摘要
(2)将转入pMA5-YwbN-WB600细胞进行发酵，获 得的培养液上清与N-甲基-DL-天冬氨酸溶液混合，针对N-甲基-L-天冬氨酸进行具有手性 选择性的生物催化；
(3)采用等电点结晶法分离得到N-甲基-D天冬氨酸。 2 .根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pMA5-YwbN-trsox质粒质粒的基因序 列如SEQ ID NO .1所示。 3 .根据权利要求1所述的方法 ，其特征在于 ，所述pMA5-YwbN-trsox 质粒 质粒转化 Bacillus subtilis WB600细胞的方法为：使用TB培养基，发酵温度为30-50℃，发酵时间为 36-72h。 4 .根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述手性选择性生物转化的方 法为：Thermomicrobium roseum肌氨酸氧化酶针对N-甲基-L-天冬氨酸进行具有手性选择 性的催化时，pH值为6-8，温度为40-70℃，时间为12-36h。 5 .根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述等电点结晶法的具体过程为， 酶转化结束后，加入0 .2-0 .5w/v％的明矾在60℃絮凝2h，板框过滤去除絮凝物，使用浓硫酸 将溶液pH值调节至2-4，将N-甲基-D-天冬氨酸洁净析出，并进行一次重结晶。
发明内容 [0005] 针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种酶法拆分制备N-甲基-D-天冬 氨酸的方法。本发明方法所用宿主菌Bacillus subtilis WB600具有较好的生物安全性，反 应条件温和，步骤简单，产物分离快速，且具有较高的回收率。 [0006] 本发明的技术方案如下： [0007] 一种酶法拆分制备N-甲基-D-天冬氨酸的方法，所述方法包括如下步骤： [0008] (1)将Thermomicrobium roseum肌氨酸氧化酶基因构建于pMA5-YwbN-trsox质粒， 并转化Bacillus subtilis WB600细胞中进行分泌性表达；