超声波复合酶法提取桑黄多糖研究_谢丽源

Key words： Phellinus linteus；polysaccharide；ultrasonic；compound enzyme；orthogonal test
中图分类号：R284.2
文献标识码：A
文章编号：1002-6630(2010)10-0081-05
桑黄是一种珍稀的药用真菌[ 1] 。医学表明，具有抗 肿瘤、抗氧化、 抗肝纤维化、 增强免疫等药理活性[ 2 - 7 ] ， 被国际公认为抗肿瘤效果最好的药用真菌之一。与大多 数药用真菌一样，桑黄水提物的主要活性成分是多糖， 而多糖是构成真菌细胞壁的主要成分，与纤维素、蛋 白质等紧密联结，不易分离。常用的热水提取方法，
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食品科学
※工艺技术
多为纤维素酶。将超声波复合酶酶解技术运用到桑黄多 糖提取的报道比较少见。本研究采用超声波和复合酶法 处理技术对桑黄多糖进行提取，即先进行超声波处理， 再进行复合酶解，并优化提取的最佳条件，旨在最大 限度提高多糖得率，为桑黄多糖的产业化提供参考。
ultrasonic power, pretreatment time and material/liquid ratio were determined to be 500 W, 20 min and 1:25 (g/mL), respectively.
The optimization of enzymatic hydrolysis leading to 6.619% polysaccharide yield was achieved through the combinatorial use
of cellulase at 2.5% dosage, pectinase at 2.5% dosage and neutral proteinase at 1% dosage for the hydrolysis for 120 min at pH
6.5 and 50 ℃. The combination of ultrasonic pretreatment and enzymatic hydrolysis may provide a good idea for the large-scale production of polysaccharides from the fermented mycelia of Phellinus linteus.
1.2.4.4 超声波正交试验 在单因素试验的基础上，采用正交试验对影响提取
的因素如时间、料液比及功率进行条件优化。
1.2.5 复合酶处理条件优化
1.2.5.1 酶解时间对多糖得率的影响 纤维素酶、果胶酶、蛋白酶组成的复合酶均在添
加量 2%、温度 45℃、pH6.5，酶解时间分别按 40、60、 80、10 0、12 0mi n 处理，测定多糖含量及计算得率。 1.2.5.2 pH 值对多糖得率的影响
2.1.1 超声处理时间对多糖得率的影响
6 5
多糖得率 /%
4
3
2
1
0
10
15
20Байду номын сангаас
25
超声时间 /min
图１ 不同超声时间对多糖得率的影响 Fig.1 Effect of ultrasound treatment time on polysaccharide yield
※工艺技术
食品科学
2010, Vol. 31, No. 10 83
１ 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器 桑黄(Phellinus linteus)菌株 10 ＃，由四川省农业科
学院微生物研究中心提供，菌株在 50L 发酵罐发酵，收 获菌体。
98% 浓硫酸、95% 乙醇、果胶酶(酶活力 7 × 104U/g) 成都市科龙化工试剂厂；纤维素酶(酶活力 15U/mg) 上 海伯奥生物科技有限公司；中性蛋白酶(酶活力 6 × 104U/g) 北京奥博星生物技术有限责任公司；苯酚、氯仿、正 丁醇均为国产分析醇。
备用。
↓
工艺流程：菌丝体→清洗→干燥→粉碎→超声处理→复合酶→
离心→上清液→醇沉→离心→沉淀→溶解→测定。
1.2.2 多糖含量测定 采用苯酚 - 硫酸比色法[13 ]。
1.2.3 多糖得率计算
多糖含量×稀释体积 多糖得率 /%= ——————————× 100
样品干质量
1.2.4 超声波处理条件优化
2.1.2 料液比对多糖得率的影响
多糖得率 /%
6
5
4
3
2
1
0
1:20
1:25
1:30
1:35
1:40
料液比(g/mL)
图２ 不同料液比对多糖得率的影响 Fig.2 Effect of material/liquid ratio on polysaccharide yield
由图 2 所示，在料液比 1 : 2 5 时多糖得率最高，随 着料液比的减小多糖得率降低，这是由于减小料液比减 弱了能量的传递效果，细胞壁未得到充分的破碎，多 糖溶出机率减小所致。
纤维素酶、果胶酶、蛋白酶组成的复合酶均在添 加量 2% 、温度 45℃、1.2.5.1 节确定的最佳酶解时间， pH 值分别按 4.0 、4.5 、5.0 、5.5、6.0 、6.5 处理，测 定多糖含量及计算得率。
1.2.5.3 温度对多糖得率的影响 纤维素酶、果胶酶、蛋白酶组成的复合酶均在添
加量 2%，1.2.5.1 节和 1.2.5.2 节确定的最佳条件，温度 分别按 35 、40 、45 、50 、55 、60 ℃处理，测定多糖 含量及计算得率。
1.2.4.1 超声时间对多糖得率的影响 准确称量 1g 菌丝体，按料液比 1:30(g/mL)加蒸馏
水，在功率 30 0W 条件下，超声时间分别按 10 、15 、 20、25m in 处理，测定多糖含量及计算得率。实验设 3 个重复。
1.2.4.2 料液比对多糖得率的影响 准确称量 1 g 菌丝体，在功率 3 0 0 W 条件下，处
四川省财政育种工程四川省农科院青年基金项目(2007QNJJ-015) 作者简介：谢丽源(1977 —)，女，助理研究员，博士研究生；研究方向为农产品加工。E-mail：xieliyuan77@163.com * 通信作者：甘炳成(1968 —)，男，研究员，硕士，研究方向为微生物及农产品加工。E-mail：bgan918@163.com
were used to deal with the effects of crucial ultrasonic pretreatment and hydrolysis parameters on polysaccharide yield. Results
showed that the optimization of ultrasonic pretreatment led to 3.356% polysaccharide yield, in which, the optimal values of
※工艺技术
食品科学
2010, Vol. 31, No. 10 81
超声波复合酶法提取桑黄多糖研究
谢丽源 1,2，王富伟 3，李洪军 1，甘炳成 2,* ，彭卫红 2，谭 伟 2，黄忠乾 2
(1.西南大学食品科学学院，重庆 400716；2.四川农业科学院土壤肥料研究所，四川 成都 610066； 3.四川农业大学资源环境学院，四川 雅安 625014)
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China；2. Institute of Soil and Fertilizer, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China；3. College of Resources and Environment, Sichuan Agricultural University, Ya,an 625014, China)
1.2.5.4 复合酶法正交试验 在超声波后复合酶解单因素试验的基础上，用正交
试验对影响提取的因素：酶解时间、复合酶添加量、 pH 值及酶解温度进行条件优化。
２ 结果与分析
超声波复合酶法提取多糖全过程为超声波处理和复 合酶酶解两个阶段，这两个阶段都很重要。第一阶段 是通过超声波空化效应对原料的破碎作用，使不易被浸 出细胞壁的化学成分和溶剂充分接触；第二阶段是在超 声波处理后再通过复合酶解细胞表面结构及胞间连接 物，使溶于水的胞内多糖浸出率增加。 2.1 超声波法处理条件优化
Abstract ：To develop an optimal procedure based on ultrasonic pretreatment followed by enzymatic hydrolysis for the extraction of polysaccharides from the fermented mycelia of Phellinus linteus, single factor and orthogonal array design methods
耗时长，多糖得率低[8 ]。 近年来，随着超声波技术被广泛的应用于真菌、
植物组织中活性物质的提取，不少研究人员也将其运用 于真菌多糖的提取[9-1 0]，但得率仍不够理想。酶解技术 有着反应条件温和、周期短、成本低等优势被运用到 真菌多糖提取中的研究也有报道[ 11 - 1 2] ，但是所用的酶大
收稿日期：200 9-07 -27 基金项目：四川省青年基金项目(2 008 ZQ0 26 -07 2)；四川省科技支撑计划项目(2 008 FZ 015 7)；
摘 要：采用单因子分析和正交试验，以桑黄菌丝体提取物中多糖得率为指标，对超声波复合酶法中影响多糖提 取效果的主要因素进行研究。结果表明：超声波提取优化工艺条件为超声处理时间 20min、料液比 1:25(g/mL)、功 率 500W，在此基础上提取多糖得率为 3.356%，在超声波优化结果基础上，进一步进行复合酶法处理，酶解最佳 提取条件是 pH6.5，酶解温度 50℃，纤维素酶添加量 2.5%、果胶酶添加量 2.5%、蛋白酶添加量 1%，酶解时间 120min，多糖得率为 6.619%，由此可见，超声波和复合酶法双重处理提取桑黄多糖是一种有效的提取方法，适 合大规模生产运用。 关键词：桑黄；多糖；超声波；复合酶；正交试验
理时间按第一步最佳得率确定，料液比分别按 1:20、 1: 25、1: 30 、1: 35 、1 : 4 0 处理，测定多糖含量及计算 得率。
1.2.4.3 超声功率对多糖得率的影响
准确称量 1g 菌丝体，处理时间和料液比分别按 1.2.4.1 节和 1.2.4.2 节最佳得率处理，功率分别按 100、2 00 、 300、40 0、50 0W 处理，测定多糖含量及计算得率。
Ultrasonic Pretreatment Followed by Enzymatic Hydrolysis for Extraction of Polysaccharides from Fermented Mycelia of Phellinus linteus
XIE Li-yuan1,2，WANG Fu-wei3，LI Hong-jun1，GAN Bing-cheng2,*， PENG Wei-hong2，TAN Wei2，HUANG Zhong-qian2
由图 1 可以看出，随着超声处理处理时间延长，细 胞破碎程度增大，内部的多糖物质便开始溶出，多糖 得率开始升高，当超声时间为 20min 时达到最大值，随 后开始回落。这是由于随着超声处理时间的继续延长， 空化效应的作用力减小，使得桑黄颗粒表面对提取的物 质吸附力增强，多糖得率有所下降。另外，超声处理 时间过长，多糖结构可能被破坏，也是造成多糖含量 下降的原因。
R-201 旋转蒸发器 上海申胜生物技术有限公司； JY92- Ⅱ DN 超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份 有限公司；PHS-3C pH 计 上海康仪仪器有限公司； GLI66- Ⅱ高速离心机 上海安亭科学仪器厂；紫外分光 光度计 日本岛津公司。
1.2 方法
1.2.1 提取工艺
将桑黄菌丝体 60 ℃烘干，研磨成粉末状过 60 目筛