免疫检验 第十三章 免疫细胞分离与检测

胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应.
体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后 的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定.
淋巴细胞分类
T细胞（负责细胞免疫功能） B细胞（执行体液免疫功能）
NK和K细胞（非特异性免疫作用）
（一）T淋巴细胞增殖试验
1. 原理：
淋巴细胞 刺激物
3．NBT还原试验
二、巨噬细胞功能检测
(一)炭粒廓清试验
正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%炭粒， 脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据此给小鼠定 量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)，间隔一定时间 反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流 中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。
(二)吞噬功能检测
巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强 的吞噬功能，常用鸡红细胞(CRBC)、白 色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒， 用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔
二、B细胞表面标志
SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体、小鼠红细胞受体
都是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有， 是鉴定B细胞可靠的指标。 成熟B细胞的mIg主要为mIg M、mIgD。
CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1
细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2 细胞为通常所指的B细胞。
吸附柱过滤法
（单核细胞贴壁生长的特点，将细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖
凝胶的层析柱中，洗脱下来的为淋巴细胞）
Percoll 分离液法
（连续密度梯度离心，不同密度的细胞悬浮于各自不同的密度区带）
Percoll法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图
三、T、B细胞和T细胞亚群的分离
E花环沉降法
(一) 趋化功能检测
1.原理：
琼脂糖平板法
(二)吞噬和杀菌功能测定
1．显微镜检查法：
吞噬细菌的白细胞数 吞噬率(%) 100 计数的白细胞数
杀菌率(%)
胞内含着染菌体的细胞 数 计数的白细胞数
100
2. 溶菌法
杀菌率(%) （ 1 作用30、 60或90 min 菌落数 0 min 菌落数 ） 100
2. 淋巴细胞转化的刺激物
非特异性刺激物： PHA ------T细胞 ConA -------T细胞 PWM -------T、 B细胞 LPS -------B细胞 特异性刺激物： 异种抗原 同种组织抗原
3. 检测方法
形态法：刺激物
同位素法：PHA
淋巴细胞（4-6天）
淋巴细胞（54h） +
母细胞化
渗出液获得鼠巨噬细胞。
第六节 免疫细胞表面标识和功能检测的临床应用
反映机体免疫功能状态。
肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测。
组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利于
排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施。
淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标。 对CD4+和CD8+T细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、 自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测。
该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。
优点：
稳定、特异、抗原用量少；
可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；
可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。
三、NK细胞活性测定
靶 细 胞 溶 解
常用靶细胞: K562细胞株(人） YAC-1细胞株(小鼠）
方法学及原理
形态法 酶释法 荧光法 同位素法 化学发光法
（三）T细胞介导的细胞毒试验
1.原理：
靶细胞抗原
T细胞
致敏CTL
靶细胞
观察杀伤活力
2.方法
形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞
计数残留肿瘤细
胞
同位素法 ：淋巴细胞（CTL）+含51Cr的肿瘤细胞
肿瘤细胞破坏
51Cr
释放
测定γ射线
意义： 肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力
(四) 体内试验
特异性抗原皮肤试验
染色计数 离心取上清测LDH或AKP 离心取沉淀测活细胞荧光
测CPM值
测发光强度
第五节 其他免疫细胞功能检测技术
吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭
作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。 一、中性粒细胞功能检测技术 二、巨噬细胞功能检测技术
一、中性粒细胞功能的检测
细胞趋化功能的检测

吞噬和杀菌功能的检测
DNA合成
分化
细胞变大
细胞浆扩大
母细胞
空泡 核仁明显 核染色质疏松
未转化和转化淋巴细胞的形态特征
转化的淋巴细胞
未转化的淋巴细胞 淋巴母细胞 细胞大小(直径μm) 12～20 核大小、染色质 核仁 有丝分裂 胞质、着色 浆内空泡 伪足 增大、疏松 清晰、1～4个 有或无 增多、嗜碱 有或无 有或无 过渡型 12～16 增大、疏松 有或无 无 增多、嗜碱 有或无 有或无 6～ 8 不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
（2）3H-TdR掺入法
优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性
强，重复性好。 （3）MTT比色法 缺点：但需一定设备条件，同时还存在 放射性核素污染问题。
试验孔A 570nm 均值 SI 对照孔A 570nm 均值
(二) T细胞分泌功能测定
体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺 激后,分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞 生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含 量、生物学活性或基因表达水平，以反映T细 胞功能。
不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同 外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞。 Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是 一种单次差速密度梯度离心的分离法。
密度梯度离心(Ficoll)离心
二 、淋巴细胞分离（去单核细胞）
贴壁粘附法
（单核细胞贴壁生长的特点、将悬液置玻璃或塑料器皿，未贴壁的为 淋巴细胞，此法易造成B流失）
Th1（IL-2、IFN-γ、TNF-β
辅助性T细胞
CD3+CD4+CD30- ) Th2（IL-4、IL-5、IL-6或IL-10 CD3+CD4+CD30+）
Tc1（CD3+Cபைடு நூலகம்8+CD30- )
细胞毒性T细胞
Tc2（CD3+CD8+CD30+）
CD4+CD25+调节性T细胞
调节性T细胞
CD8+调节性T细胞
PHA皮肤试验
二、B细胞功能检测
溶血空斑试验
B细胞抗体形成功能的检测
体内试验
(一) 溶血空斑试验
经典溶血空斑形成试验 2. 方法学： 被动溶血空斑试验
溶血空斑试验主要用于测定药物和手术
等因素对体液免疫功能的影响
评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗
体的能力。
(二) 酶联免疫斑点法
应用与方法学评价：
三、NK细胞表面标志
人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，
临床上将CD3-CD16+CD56+淋巴细胞认定为NK细胞。
第三节抗原提呈细胞表面标志的检测
抗原提呈类细胞表面标志
第四节 淋巴细胞功能检测
淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。 体内实验主要是进行迟发型超敏反应，间接了解淋巴细
对流式细胞仪的影响 分离条件要求 收率 纯度 分离时间 分离成本
第二节 淋巴细胞表面标志的检测及亚群分 类
常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志是簇分化抗（CD）。
一、T细胞表面标志及其亚群
CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞 （help T cell,Th） CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 （cytotoxic T cell,Tc or CTL） CD4+CD25+ Foxp3 +调节性T 细胞 （regulatory T cell,Tr or Treg）
（T细胞与绵羊红细胞 形成E花环后用淋巴细胞分层液分
离， E花环沉在管底）
尼龙毛柱分离法
（B细胞和单核细胞易粘附于尼龙纤维表面，将用
HANKS液浸泡后的单个核细胞悬液加入充填有尼龙毛
的聚乙烯塑料管内，洗脱液中为T细胞，然后边冲边挤
压塑料管，洗下B细胞。
大小免疫磁珠分离细胞的特点比较
比较项目 对细胞的影响 大磁珠 对细胞造成机械压力，影响 其生物学活性，不利于分离 后培养。 阻塞流式细胞仪的喷嘴，影 响散射光。 技术简单，分离可在试管中 完成。 得率高。 纯度低。 分离速度快。 成本低。 小磁珠 对细胞温和，不影响分离细 胞的后续培养。 可直接上流式细胞仪检测， 不影响散射光。 需要很强的磁场来分离细胞。 得率不高。 纯度高。 分离速度慢。 需要很强的磁场来分离细胞， 需要一次性的分离柱，不能 在普通试管进行。
DNA合成期
3H-TdR掺入
收集细胞
检测β射线 测定细胞内的3H-TdR
（1）形态学检查法
转化率 转化的淋巴细胞数 转化和未转化的淋巴细 胞数 100%
方法学评价：
优点：形态学方法简便易行，普通光
学显微镜便能观察结果，适于基层实验 室应用。 缺点：是依靠肉眼观察形态学变化， 判断结果易受主观因素影响，重复性和 准确性较差。
第十三章 免疫细胞分离与免疫细胞
功能检测及应用
【掌握】外周血单个核细胞、淋巴细胞、T细胞亚群分离的原 理；T、B细胞、NK细胞主要的表面标志。各种淋巴细胞功能 检测的原理.
细胞分离基本原理
不同细胞密度不同
人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090