第七章抗原抗体反应

区，形状似火箭。 抗体浓度保持不变，峰的高度与抗原量呈正比。
抗体的量一定
沉淀线高度与抗原量成正比
二）免疫标记技术
用放射性同位素、酶、荧光素等标记抗体或抗原等所进行
的抗原抗体反应。常用方法有：放射免疫检测技术、免疫
荧光技术、酶免疫技术等。
特点：敏感度高、特异性强、快速， 能进行定性、定量、定位检测
光寿命长，待蛋白等发出的非特异荧光消失后再测）控制。
③ 流程
固相固定Ag
340nm 紫外光
光
613nm
④ 方法分类：
直接法
间接法 直接夹心法
间接夹心法
洗涤
AbEu3+
Ag- AbEu3+
β二酮体 增强液
微胶囊
⑤ 检测：用时间分辨荧光计检测荧光强度。
2、发光免疫分析（）
1）发光物质 ① 化学发光：
白蛋白区、球蛋白α1区、球蛋白α2区、球蛋白β区、
球蛋白γ区
正常血清
待测抗原
沉淀弧可显示样品与对照血清蛋白组分的增加或减少情况
② 对流免疫电泳（电渗析）： 在电场的作用下，抗原、抗体进行相对运动，具有定向加 速度的免疫双扩散技术 。
方法及原理： 琼脂板上打两排孔，负极孔加待测抗原，正极孔内加相应
灵敏，精确 不稳定
安全性差
放射性同位素标记分析法示意图
（二）酶联免疫吸附试验（）
将待测抗原或抗体吸附于固相表面（聚苯乙烯微量反应 板） ，与酶标记的抗体或抗原反应后，加入底物反应（显 色或发光）的分析方法。
1、原理
酶标板吸附 抗原或抗体
洗涤
加入酶标抗体或抗原
显色反应
加入酶作用底物
2、 用于标记的酶：
体，抗原、抗体分别呈辐射状向含胶内扩散，当抗原与 抗体在胶内相遇，且二者的量达一定比例时则形成可见
的沉淀线。
应用：
① 定性分析： 鉴别抗原与抗体反应间的特异性如何：根据相邻孔中
不同抗原与同一抗血清反应形成的沉淀线形状的变化 判断抗原间是否存在共同的。
② 定量分析：
测定抗血清效价及抗原的最佳浓度。
两孔抗原
加快反应速度；提高免疫沉淀的灵敏度。
3）免疫电泳的方法 ① 血清免疫电泳
A、方法：
抗原电泳
抗体扩散
形成沉淀线
B、操作步骤：
先将抗原进行电泳，分离成不同的区点（带）； 在琼胶中沿电泳方向挖一平行小槽，加入抗血清，让抗原 和抗体进行自由扩散，两者在合适的比例下形成沉淀弧。
根据各蛋白所处的电泳位置，可分为：
四）补体参与的反应
1、反应特点：
抗原抗体复合物激活补体，被活化的补体成分可与抗原 抗体复合物结合；补体被复合物结合后即被消耗。
2、反应类型
1）溶菌反应： 某些革兰氏阳性菌，与相应抗体结合后，形成抗原抗体
复合物，在加入补体，则出现的细菌溶解现象。
2）溶血反应：
红细胞与相应抗体特异性结合后，在有足量补体存在条件 下，出现红细胞溶解的现象。
（一）放射免疫分析（） ： 用放射性同位素标记的抗原或抗体，通过免疫反应来进行
测定的技术，可进行抗原或抗体的定量分析。
1、常用来标记抗原或抗体的同位素： 125I、131I、3H、35S
1）125I，131I的标记 — 氯胺T法：
氯胺T法标记原理：
氯胺T 是氯代酰胺类氧化剂，在水中不稳定，产生的
氯离子将碘离子( )氧化为单质碘( I2 )，单质碘与抗原 或抗体分子上的苯丙氨酸及酪氨酸残基的苯环或组氨酸 的咪唑基共价相连，使之发生碘化反应。
洗涤
Ab酶或 Ag酶
Ag－Ab酶 或
Ab－Ag酶
底物
显色反应
酶联免疫吸附试验——直接法
（2）间接法（有两种抗体参与，一抗做反应桥梁）
1
2酶
酶标板吸附抗原
Ag－1Ab
洗涤
底物 显色反应
酶
联
免
疫
吸
附
实 验
一抗
间
二抗
接
法
Ag－1Ab－2Ab酶
（3）夹心法（不同抗体将抗原夹在中间反应）
① 直接夹心法
Ag 酶标板吸附抗体
的某一部分出现白色沉淀线的现象。
凝胶扩散实验分为：
单向琼脂扩散（定性、定量分析）
双向琼脂扩散（定性分析）
三）中和反应： 抗体使相应抗原（毒素或病毒）的毒性或传染性丧失的反应 。
抗毒素：使相应毒素失去毒性的抗体。
中和抗体：使相应病毒丧失传染性的抗体。
中和反应应用：
毒素或病毒种型的鉴定与抗原性分析； 抗毒素或中和抗体的效价测定。
检（待）测系统 补体系统
指示系统
溶血
补体结合阴性反应 （－），无待测物
不溶血
补体结合阳性反应（＋ ），含待测物
二、 常见免疫分析方法
1、免疫分析的定义： 利用抗原抗体的特异性反应的特性对抗原或抗体进行量和
质的测定分析。
2、特点： • 特异性强 • 灵敏度高
• 反应速度快
一）免疫沉淀
1、环状沉淀反应
抗血清的效价为 1:16
最佳抗原浓度为： 1:16
3、免疫电泳： 利用蛋白质在凝胶中电泳移动速率不同而被分离的特性
与免疫琼脂扩散结合起来的分析方法。
1）原理：
8.6时，混合蛋白抗原多数带负电，向正极移动（少数 带正电的则向负极移动），不同抗原分子因大小及所带 电荷不同，其电泳速度不一样而被分离。
2）特点：
A、标记物质：荧光醇、异荧光醇、吖啶酯等。 B、催化剂：阳离子、酶、酸性条件 + 过氧化氢
② 生物发光：
A、标记物质：虫荧素
B、发光剂：虫荧酶 + + 2+ + O2
2）方法及原理：同。 3）测定方法：用瞬时荧光仪测定其发光强度。
（四）亲和标记免疫分析
利用被标记物质与检测物质间具有高度亲和力使两者进行特
抗体/抗原，再与吸附于固相表面的抗原/抗体反应，激发抗
原抗体复合物发（荧）光，借此对抗原/抗体进行定性或定位。
Ab光或Ag光 固相吸附抗原或抗体
Ab － Ag光 或
Ag－Ab光
催化剂
发光
1、荧光免疫分析
① 标记物质：
荧光素、3价稀土镧系元素铕离子( 3+ )、铽离子（3+）等。
② 常用方法：时间分辨荧光免疫分析（） 借助波长（激发光与荧光波长区别较大）及时间（3+荧
完全融合
互不干扰 的交叉线
同一血清与不同抗原反应
向共同Ag 方向突出
定性分析
双向免疫扩散定量分析：测定抗血清效价及抗原的最佳浓度
抗原 稀释度 不稀释
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64
不稀释 ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋
＋＋ ＋ ＋
抗血清稀释度
1/2
1/4
1/8 1/16 1/32 1/64 1/128
底物 显色反应
Ab - Ag
洗涤 Ab酶
Ab - Ag - Ab酶
② 间接夹心法
Ag 酶标板吸附抗体
Ab － Ag 1Ab
Ab － Ag－ 1Ab
洗涤 2Ab酶 Ab －Ag－1Ab－ 2Ab酶 底物
显色反应
酶联免疫吸附实验——夹心法
（三）荧光与发光免疫分析
用荧光素（异硫氰酸荧光素、藻红蛋白）或发光化合物标记
125I，131I的标记 — 氯胺T法：
2）3H的标记 —（N - 琥珀酰亚胺[2，3-3H]丙酸酯 ） 活泼酯基易和蛋白质的游离氨基反应 。
2、标记方法
液相用液体闪烁仪 计数，固相用X射线
胶片显影
标记或
标记物纯化
方法：电泳 层析
超速离心
测定其放射活性
抗原抗体反应聚乙二醇
沉淀分离
抗原抗体复合物沉淀
抗体，通电后，带负电荷的抗原泳向正极抗体侧，而抗体 （8.6时带负电）藉电渗作用流向负极抗原侧，在两者间形
成沉淀线。（电渗：电场中液体对于固体支持物的相对移动）
琼脂中含42-，带负电，其静
电感应使附近水带正电，而向 负极移动。电泳时有电泳力和 电渗力两种力。若物质原来带 正电，向负极移动，则因电渗 作用向负极移动得更快。若物 质向正极移动，所带电荷少， 电泳力小于电渗力，也向负极
应用：抗原抗体的定性及定量分析。
方法：试管法，玻片法
常用已知抗体来
检测未知抗原。 定量实验时，由 于抗原分子小， 反应面积大，且 为保证与
的适宜比例，有 足够的抗体参与
反应，操作上通 常是稀释抗原
（上层），而不
稀释抗体（下层） 与图示相反
2、凝胶扩散沉淀
1）单向扩散法（法）： 将抗血清均匀地混合于琼脂糖凝胶（浓度为：0.8~1% ）
第五节 常见免疫分析方法
一、抗原抗体反应类型
凝集反应、沉淀反应 、中和反应、补体参与的反应等。
一）凝集反应 ： 1、定义：
颗粒性抗原与相应抗体相遇后，在电解质参与下出现肉眼
可见凝集物的现象。
2、参与要素：
① 凝聚原：参与凝聚反应的抗原，如：血细胞、菌体等。 ② 凝聚素：参与凝聚反应的抗体。
3、类型
＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ － －
＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ － －
＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ － －
＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ － －
＋＋
＋＋
＋
＋ ＋－－
＋
＋
＋
－ －－－
＋
＋
＋
－源自文库－－－
表中＋～＋＋＋代表出现沉淀线的强度， 如：
1:8 、1:16抗体出现中等浓度沉淀线， 1:32出现较弱的沉淀线。
移动，如：血清中的γ球蛋白
电渗力
电泳力
抗原和抗体在电 场中相向运动
③ 火箭电泳：
在电场的作用下，进行的免疫单向扩散技术 。
A、方法及原理：
在含抗体的琼脂板负极端打一排抗原孔；加入抗原进行电
泳，抗原泳向阳极，在抗原抗体比例恰当处发生结合沉淀。
B、反应特点：
随着泳动抗原的减少，沉淀逐渐减少，形成峰状的沉淀
①直接凝集反应（定性实验，检测抗原或抗体）：
颗粒性抗原与相应抗体在有电解质时，直接结合所出现
的凝集现象。
常用方法：
A、玻片法：细菌及血型鉴定（标准血清检测抗原）
B、试管法：肥达氏反应（伤寒或副伤寒杆菌标准液检测血清 ）
② 间接凝集反应（检测可溶性抗原或抗体）：
将可溶性抗原吸附于与免疫无关的小颗粒（载体）表面 后，与相应的抗体在电解质存在的下而发生的凝集反应。
② 沉淀素：参与沉淀反应的抗体。
3、类型：
① 环状沉淀反应： 将已知抗原（抗体）注入特制小试管中，再沿管壁徐徐加入
适量抗体（抗原），在两液界面出现白色的沉淀圆环的现象。
② 絮状沉淀反应：
将已知抗原与抗体在试管内混匀后，出现肉眼可见的絮
状沉淀的现象。
③ 凝胶扩散试验： 利用可溶性抗原、抗体在半固体琼脂内扩散，在其扩散
内，倒平板，平板打孔，孔中加入待测的抗原样品，抗 原呈辐射状向含抗体的胶内扩散，至抗原与抗体的量达 一定比例时形成可见的沉淀环。
一定条件下沉淀环的直径或面积与相应的抗原含量成正比。
应用： 定性与定量分析，常用于测定血清中、、及补体的含量。
2）双向扩散法（法）：
在琼脂糖凝胶平板内打两排孔，孔中分别加入抗原、抗
Ag-Ab酶 或
Ab-Ag酶
碱性磷酸酶（）、辣根过氧化物酶（）、脲酶、
β- 半乳糖苷酶等。
• 不同的酶催化的底物不同，显色产物吸收的波长不同。 • 有显色反应为正反应；无显色反应为负反应。 • 被检测的抗原或抗体的量与显色产物的量呈正比。
3、方法 （1）直接法（可检测抗原或抗体）：
酶标板吸附 抗原或抗体
Ag＊-Ab 沉淀分离
+
放射活性测定
Ag-Ab
标记抗原与非标记抗原和特异抗体结合的能力相同
抗原表位之和（标记+非标记的）多于特异性抗体的结合位
点（抗原过量，抗体完全反应）。
放射活性与抗原 量成正比
抗原量一定，标记 的抗体和非标记的 抗体与抗原竞争结 合，放射活性与待 测抗体的量成反比
反应特点：
不含待测抗原，产生凝集，但为阴性反应
+
含有待测抗原，不凝集，阳性反应
+
+
Patient’s sample
二）沉淀反应： 1、定义：
可溶性抗原与相应抗体在一定条件下，出现细微沉淀物的 现象。
2、参与因素：
① 沉淀原：参与沉淀反应的抗原。
包括：蛋白质、多糖和类脂溶液、血清、细菌抽提液、 组织浸出液等。
常用载体颗粒： 红细胞 [人（ O 型）和动物（绵羊、兔鸡等）]、胶体颗粒、 聚苯乙烯乳酸、活性碳等
间接血细胞凝集试验：以红细胞作为载体的凝集反应。
③ 凝集抑制实验
将可溶性抗原与相应抗体预先作用，然后再加入致敏颗粒（吸附相 同可溶性抗原的乳胶颗粒）, 由于抗体已被可溶性抗原结合, 因而致 敏颗粒不发生凝集现象。如免疫妊娠实验测验尿中（乳胶凝集抑制 试验，无凝集者为阳性）。
3）补体结合反应 ： 在补体参与下，并以绵羊红细胞和溶血素（抗绵羊红细胞 的抗体）为指示系统的抗原抗体反应。
3、补体结合反应系统：
① 检（待）测系统：
待测的抗原+ 抗血清（抗体、补体）
② 指示系统： 绵羊红细胞（抗原）+ 溶血素（抗体）
③ 补体系统 豚鼠的新鲜血清
4、反应过程
红细胞+溶血素 抗原 + 抗血清 + 豚鼠新鲜血清
3、检测方法：直接法和竞争法
1）直接法：放射活性与抗体浓度呈正比
Ag＊＋Ab （定量）
Ag＊-Ab 沉淀分离
放射活性测定
2）竞争法：放射活性与待测抗原（未标记）浓度呈反比
体外条件下，由非标记抗原（抗体）与定量的标记抗原
（抗原）对限量的特异性抗体（抗原）的竞争性抑制的反应。
[Ag＊＋ Ag] ＋Ab 定量 待测 限量