动物细胞的原代培养

动物细胞的原代培养
细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，使其不断生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。

细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。

其特点包括：大量实验材料；单一、纯粹细胞类型培养基的成分可控，即生长条件可控/全合成、无血清培养基；易于观察；易于操作。

细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术。

一、实验目的
了解动物原代细胞培养的基本方法及操作过程；初步掌握无菌操作方法；观察体外培养细胞的生长特征。

二、实验原理
原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。

这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。

直接从身故体内分离的细胞，在体外培养的过程中尚未发生细胞分裂、增殖的细胞即为原代培养细胞；原代培养细胞在一定条件下可以继续增殖，在数量上大量扩增，此时的细胞为继代培养细胞。

细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。

要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。

二是严格控制无菌条件。

三、实验用品
1.器材
①解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、移液管、橡皮头、培养瓶、玻璃匀浆器、
1.5ml离心管等。

上述器材均需彻底清洗、烤干、包装好，高压灭菌20min，备用。

②倒置显微镜、离心机、酒精灯、酒精棉球、试管架、记号笔、大头针、解剖板等
2.试剂
完全培养液
不完全培养液90%
小牛血清10％
双抗（链霉素、青霉素）（1万单位/mL）加至约为100单位/mL
7.4%NaHCO3调pH至7.0-7.2。

不完全培养液：DMEM液或1640液
PBS缓冲液或生理盐水
以上溶液均经适当包装，灭菌后备用。

（细胞培养基要满足细胞的生长需要，包括pH、渗透压、营养和生长因子等以保证细胞的增殖。

细胞培养箱常指二氧化碳培养箱，它可以提供合适的温度和二氧化碳浓度。

二氧化碳和培养基中的缓冲系统共同作用，保持细胞培养液的酸碱度。

超净台通过将空气进行过滤，为细胞培养的各种操作提供了一个干净的环境，使细胞培养免于细菌和真菌的污染。

在细胞原代培养的操作过程中，这个设备是必要的，细胞本来就比较易感染，不易存活，在空气中，以及人体表面存在许多易感染细菌，所以为了提高细胞的存活率，一定要保持操作过程干净，无污染。

）
3.材料：小白鼠
四、实验方法
1．拉颈处死小白鼠后，将小白鼠放入超净工作台中盛有70%的酒精的烧杯中灭菌5min。

将小白鼠用大头针固定在解剖板上，使其腹部向上。

2．在小白鼠腰部后缘（腹部左侧），用解剖镊提起皮肤，用解剖剪剪开皮肤，将剪开的皮肤分别拉向两侧。

此时，再换一把解剖剪及解剖镊，剪开腹腔膜，暴露出腹腔，即可见脾脏（肝脏或肾脏等）。

用弯头眼科镊取出脾脏（肝脏或肾脏等），置于无菌培养皿中，去除脂肪等，用不完全培养液（或PBS液、生理盐水）冲洗。

3．用眼科剪及镊子，将脾脏剪成小块（1mm2）。

将剪碎的脾脏转入玻璃匀浆器中，加入少量不完全培养液进行匀浆。

匀浆后将匀浆液转入1.5mL离心管中，1000rpm离心5min。

弃上清，重悬于不完全培养液中。

4．如仍有较大组织块，将悬液通过200目不锈钢网，离心洗涤一次（1000rpm，离心5分钟，弃上清液）。

5．加入完全培养基，反复吹打沉淀，直到沉淀均分散成混淆的细胞悬液为止。

血球计数板计数。

6．培养瓶中预先加入适量完全培养基（以覆盖住瓶底为宜）。

将上述细胞悬液分装于培养瓶中，盖
紧瓶塞。

将细胞调整到5×105/ml左右。

细胞计数方法：
①试剂配制：用生理盐水配成5%Tyrpen Blue（台酚蓝）染液，备用
②染色计数：
取0.5mL细胞悬浊液放入试管中，加入1-2滴染液。

混
合。

2-5min后将细胞放在血细胞计数板上观察死活情况，注
意不要有气泡产生，放大倍数为10x10。

染色后活细胞不着色，
死细胞显示蓝色。

注意染色时间不能超过15min，否则染液
将细胞毒杀。

③计数：
在10x10倍的显微镜下观察，计算血细胞计数板的4个4小方格的细胞数量。

包括细胞总数与死细胞数量。

压线者计上不计下，计左不计右。

7．将培养瓶放置于倒置显微镜下观察细胞形态。

8．将培养瓶置于CO2培养箱中进行培养。

9．观察
置于37℃培养的细胞，需逐日进行观测，主要观察：
①培养物是否被污染，如培养液变成黄色且混浊，表示该瓶被污染。

②细胞生长状况与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。

可能是瓶塞未盖紧或营养液pH过高。

③培养液若变为桔红色，一般现实细胞生长良好。

五、无菌操作的几个注重事项
1、操作前要洗手。

进入超净台前手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。

试剂等瓶口也要擦试。

2、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行。

耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火。

并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。

3、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。

4、不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。

5、瓶子开口后要尽量保持45°斜位。

6、吸溶液的吸管等不能混用。