分子生物学阅读延伸译文

1.研究相互作用蛋白质组学的意义？
蛋白质很少单独发挥其功能，通常都是多种蛋白质形成复合物起生物学作用，全球范围内蛋白质-蛋白质相互作用的研究，也就是所谓的相互作用组学已经成为非常重要的现代分子生物学。

蛋白质是所有细胞的重要组成部分，大多数细胞行使功能时蛋白质之间的相互作用是必不可少的。

如基因转录，细胞周期调控，信号转导或监控过程中等的基本过程都依赖于正确的功能蛋白质复合物。

“后基因组”时代的重要里程碑之一是功能注释的基因组数据的积累。

蛋白质形成时的干扰或对组织内蛋白质复合物的干扰，往往会导致细胞功能障碍，最终导致疾病。

而且,在不同的组织和细胞中,蛋白质复合物的组成并非一成不变,为适应细胞生长的微环境变化,蛋白质复合物的各组成成分还存在着时间和空间的表达差异性。

因此,在组织或细胞中众多蛋白质协同发挥生理作用的过程中,蛋白质复合物的组成分析尤其重要，这也进一步要求我们充分揭示一个细胞或组织中完整的蛋白质-蛋白质相互作用网络—蛋白质相互作用组。

2.相互作用蛋白质组学的研究方法有哪些?
答：⑴生物化学方法：①免疫共沉淀法；②亲和层析法。

⑵遗传学方法：①yeast two-hybrid;
②Protein-fragment complementation assay(PCA);③Membrane yeast two-hybrid(MYTH);④Resonance-energy transfer (RET) systems包括FRET、BRET、BRET-FRET(SRET)、TR-FRET和FRAP;
⑤luminescence-based mammalian interactome mapping(LUMIER);⑥The mammalian protein-protein interaction trap(MAPPIT) and its variants(Array MAPPIT、MASPIT和Reverse MAPPIT);⑦Phage display;⑧Protein microarrays 。

①酵母双杂交②蛋白质的片段互补分析（PCA）;③膜酵母双杂交（MYTH）;④共振的能量转移（RET）系统包括FRET，BRET，BRET，荧光共振能量转移（SRET），TR-FRET和FRAP;⑤基于发光的哺乳动物相互作用组的映射（LUMIER）;⑥哺乳动物的蛋白质-蛋白质相互作用的陷阱（MAPPIT）及其变种（的阵列MAPPIT，MASPIT和反向MAPPIT）;⑦噬菌体显示屏;⑧蛋白质微阵列。

3.与传统蛋白质相互作用研究方法相比，相互作用蛋白质组学的优势在哪里？
答：相互作用蛋白组学技术可以在生理条件下获得与靶蛋白相互作用的蛋白质，候选蛋白质与靶蛋白的结合机会均等；灵敏度高；鉴定出在空间上非直接物理相互作用的蛋白质，避免假阳性出现；检测多亚基蛋白质之间的相互作用；能适用于大规模蛋白质相互作用的研究等。

传统方法由于其粗糙性和经济承受能力HTP互动目前可用的数据仍然是基于经典的Y2H。

虽然它最近已表明，Y2H网络提供高品质的二进制交互信息，但该方法具有的固有的局限性，
如收缩相互作用的核和使用酵母作为宿主系统。

而现在的方法是以酵母系统为基础，应用哺乳动物系统，因此提供了一些优势，并且，他们往往是技术上的挑战，而不是扩展到HTP 格式。

如的PCA，RET为基础的方法或MAPPIT操作方法在哺乳动物细胞中，它可以补充耦合质谱方法（AP-MS）。

这是经常选用的方法，因此HTP PPIs类药物的研究被广泛使用的亲和纯化。

虽然AP-MS需要相对严格的生化隔离的蛋白质复合物，但它可以适用于宽范围的细胞类型。

随着相互作用蛋白质组学的成熟可以有更多新颖的发现，也可以使我们更好的了解细胞内蛋白质之间的相互作用。

1.基因芯片在医学中有何应用？
（1）发现新基因（2）基因表达分析（3）DNA序列测定与序列间比较（4）突变体和多态性的检测（5）疾病的诊断。

（6）药物研究的重要技术平台，大量应用与耐药性检测、药物靶点寻找、高通量的药物筛选、药物作用机制和毒理研究等。

2.基因芯片的使用应注意哪些问题？
①根据研究课题的需要来选取相关基因芯片。

②基因芯片的数量：每实验组应最少有5~6块基因芯片才具有统计学意义。

③利用基因芯片时必须了解在什么时间取材和取什么组织进行检测的问题。

在什么时间取材需要研究者根据相关文献和实验目的而定。

取材时应注意不要将无关组织带入实验材料中，以免影响取材的准确性。

④组织的取材量由组织类型和基因芯片的一次成功率决定。

⑤不能单凭基因芯片检测结果而对不同表达的基因之间的关系做出结论。

⑥随着蛋白芯片技术的发展，将基因芯片技术与蛋白芯片技术结合使用，可提高实验结果的可靠性和准确性。

⑦可采用与基因芯片公司合作的方式进行，在合作中，应就实验的设计等问题与基因芯片公司协商。

避免由于实验设计等原因导致实验的失败。

同时，应与基因芯片公司签订有关合同，明确双方的义务和责任。

3. 基因芯片有哪些优点和缺点？
优点：检测效果：准确、可靠、灵敏。

检测方法由由荧光扫描仪检测，计算机自动分析，方便、快捷。

成本低。

与传统诊断区别：直接以病理基因（致病基因、疾病相关基因和外源性病原生物基因等）为分析对象。

可以一次性对样品大量序列进行检测和分析。

缺点：技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析泛围较狭窄等。

中枢神经系统(CNS)结核，特别是结核性脑膜炎(TBM)是结核分枝杆菌(M.Tb)感染最为严重的形式，尽管近期在抗结核治疗方面取得了一定进展，但是在感染的患者中一半以上会出现死亡或严重的中枢缺陷。

CNS结核的决定性诊断取决于脑脊液（CSF）中M.Tb的检测。

现在CNS结核的诊断依然是个难题，因为在TBM急性阶段广泛应用的细菌学检测方法的“金标准”（如直接涂片和细菌培养）在检测CSF标本中的M.Tb时敏感性并不高。

与传统的“金标准”不同, 最近多种分子学方法包括核酸扩增(NAA)分析技术，特别是聚合酶链式反应(PCR)分析法，已经作为一个诊断CNS结核的新兴方法浮现。

因其有快速、敏感和特异的特点。

此外，巢式PCR分析技术的革新值得关注，因为他能改进CNS结核的诊断。

本文中，对最近的NAA方法，主要是PCR技术作一概述。

1、简介
在美国，由M.Tb引发的CNS疾病特别是结核性脑膜炎(TBM)并不常见，占所有结核病例的1%左右。

中枢神经系统(CNS)结核是结核分枝杆菌(M.Tb)感染最为严重的形式，尽管近期在抗结核治疗（ATT）方面取得了一定进展，但是在感染的患者中一半以上会出现死亡或严重的中枢缺陷。

此外，由于广泛传播的AIDS引起越来越多的免疫功能不全的的群体、逐渐增加的老龄化人群、免疫抑制剂的广泛应用等原因，使得TBM成为一个严重的临床和社会问题。

因为CNS结核相对稀少且引起的中枢症状无特异性，所以其诊断有很大难度。

对于TBM 来说，针对结核进行准确快速诊断和早期治疗尤为重要，否则会导致预后不良和长期的神经方面的后遗症。

然而，M.Tb传统的基于细菌学的金标准检测法包括直接涂片进行抗酸染色（AFB）和细菌培养不能对其进行早期诊断，因为敏感性较低且培养时间过长（4-8周）。

最近，用各种分子学方法，包括NAA分析技术，特别是PCR分析方法用于检测CSF中M.Tb DNA已经作为一个诊断CNS结核的新兴方法浮现。

因其有快速、敏感和特异的特点。

许多学者认为虽然不同的实验室和每种类型的检测方法之间的PCR敏感性有着显著差异(65–83%)，但是不能用PCR法检测CSF中的M.Tb DNA。

而且，有报道将巢式PCR法作为检测CSF中M.Tb DNA的强效方法。

与传统的单级PCR相比，这种新方法可显著增强DNA扩增的敏感性和特异性。

然而，由于其步骤繁琐耗时且有较高的交叉污染的风险，所以用巢式PCR检测CSF以诊断TBM还有待于改进。

目前，常规诊断实验室检测用实时PCR法。

除了进行常规的定性分析，实时PCR以其高度复制性使精确定量分析成为可能。

本文作者聚焦与NAA分析技术特别是PCR法的最新进展，并对期刊中和临床上关于CNS结核诊断的演进作一概述。

2、结核的全球流行病学负担
2007年，据世界卫生组织(WHO)统计每年会有9.27百万活性结核新增病例，这导致每年约1.6百万人死亡。

结核依然是一个世界性负担，在不发达国家和发展中国家有大量新增病例。

实际上，在结核发病率上印度、中国、印度尼西亚、尼日利亚和南非依次位列第一到第五位。

在80%的新增病例中，像贫困、过度拥挤、营养不良和免疫系统功能不良等社会和人口统计学因素在其世界范围内流行起重要作用，而余下的20%结核患者与撒哈拉以南非洲中的HIV
有关。

在2007年新增的9.27百万病例中，约有1.37百万(14.8%)HIV阳性。

CNS感染是结核最为严重的感染形式之一。

在美国针对肺外结核进行的大范围流行病学研究中CNS相关的病例占总肺外结核的5-10%，与2010年CDC新进估计的5.5%（CVS结核占总结核病例的 1.2%）相近。

在CNS结核最大的前瞻性流行病学研究中，从加拿大收集的1970-2001年间82764个结核病例中，CNS结核的发病率接近1.0%。

然而，尽管在像美国这样的发达国家中结核病例的总数量在减少，但是，有报道表明肺外结核所占比例在渐进式增加。

造成这一现象的原因在于近年来免疫功能不全患者的增加和HIV/AIDS流行率的盛行。

此外，尽管结核的基于人口的总死亡率较低且正在减少，但是已有研究显示伴有肺外结核（包括CNS结核、TBM和传播性疾病）患者的死亡率会显著增加
现已确认几个引发CNS结核的风险因素。

年龄（儿童>成人）和合并HIV感染的患者均属患CNS的高风险因素。

其他危险因素包括营养不良、近期小儿麻疹、酗酒、肿瘤成人免疫抑制剂的应用和社区流行的疾病。

发达国家中有研究表明在CNS患者中，外国出生的个体（即出生于发达国家以外国家的人）呈现出更高的患病率。

3、CNS结核的现行诊断方法
现在，CNS结核诊断依然是一复杂问题，因为像直接涂片抗酸染色和M.Tb培养等广为应用的传统的细菌学检测方法不能快速检测出CSF标本中的M.Tb，因其在TBM急性阶段敏感性较差。

考虑到CNS结核的预后和长期神经后遗症，其急性阶段的快速准确诊断和早起开始ATT治疗显得尤为重要。

基于微生物技术进行的传统的“金标准”在诊断TBM时敏感性较差且不能及时得到结果，而临床要求诊断方法要更为敏感、快速、精确。

现已有应用于结核病呼吸道标本的检测技术，从这些技术中抽出几个基于分子的方法对CNS结核进行诊断，这种做法是否合适仍处于评估阶段。

这些技术包括商品化的NAA法和其他PCR类方法。

此外，像磁共振成像（MRI）等神经放射成像技术的应用显著提升TBM和结核诊断的准确性。

最近，有大量应用神经放射成像技术评估CNS结核的报道。

公认的TBM神经放射方法用于基础脑膜强化、脑积水和幕上脑实质和脑干梗塞的诊断。

而且，通常认为脑内结核瘤强度有高有低。

伴有不规则壁的圆形或分叶状肿物，并且调节对比度后呈均质或环状增强。

然而，当只用神经放射成像技术时，无法区分结核瘤和其他想像真菌颗粒这样的脑内集聚性损伤。

因此，我们认为是基于分子学的技术和神经放射成像结合的方法是有发展前景的方法，在诊断TBM和结核性肿瘤中非常好，而不是伴或不伴有经典的细菌生物学技术的神经放射成像技术。

肺结核的研究和治疗
4、PCR技术的最新进展
诊断M.Tb的NAA法是通过对来自痰液或CSF等临床标本进行M.Tb的DNA或RNA提取和扩增，以检测是否含有结合杆菌。

PCR技术是典型的DNA扩增方法。

鉴于PCR分析技术的最新成就和进展，在这部分，我们对其原理做一概括。

4.1PCR的基本原理
图1简要阐释了PCR的基本原理。

从根本上说，PCR分析技术依赖与热循环，包括重复加热和冷却以使DNA变性及其酶的复制。

短的DNA片段称为引物，他有与含DNA酶的靶区互补的序列，是使特异性DNA序列扩增的重要组成部分。

热循环的第一步是在高温（94-98℃20-30秒）下进行双链DNA的物理分离。

这被称为DNA变性阶段。

在较低温度(50–65◦C 20-40秒)下，将与靶DNA互补的引物退火到每一个单链DNA模版上，该步为退火阶段。

PCR的特异性主要来源于与模版序列完全匹配的引物序列和取决于于引物长度的退火温度。

DNA多聚酶连接到引物-模版杂交链上开始DNA复制。

DNA聚合酶从5‘到3’方向组装合成一条新的与DNA模版互补的链，该步叫延伸。

一般来说，几乎所有的PCR均需要耐热的DNA聚合酶，如最初从嗜热水生菌中分离出的Tap聚合酶。

结果，它实现了连续重复热循环程序，即交替的加热和冷却步骤。

进行热循环时，合成的DNA片段自身作为模版进行复制，成为一个连续的链式反应，使得DNA模版成倍的扩增。

用琼脂糖凝胶电泳的方法根据扩增的DNA片段长度（分子量）的不同将其分离。

然后用含EB（溴化乙定）的溶液处理，EB是在琼脂糖凝胶电泳中使DNA条带可见的最常用的染料。

因为在UV灯下EB荧光嵌入DNA主要的槽中，经EB处理后，可见明显的扩增的靶DNA片段的条带，进而进行检测。

4.2、巢式PCR法原理
图1b为巢式PCR法的基本原理。

巢式PCR法是改进的PCR法，旨在显著增强扩增效率、减少因非目标引物结合位点扩增引起的非特异性PCR产物。

尽管普通PCR特异性取决于与靶DNA序列结合的引物的互补性，但引物常与其他相似的DNA区域结合，产生像引物二聚体、发夹结构和替代性目标序列这样的不相关的PCR产物。

巢式PCR使用两对引物，应用于PCR 的两个连续性步骤中。

特别是，第二对引物在首步PCR产物中进行再次扩增；这就是“巢式”这一概念的来源。

第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。

然而，第二对引物结合在第一次PCR产物内部进行第二步PCR产物扩增，第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。

巢式PCR的优点在于如果第一步扩增了不相关或非特异性片段，第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。

因此，巢式PCR是一项非常好的技术，他可通过两步扩增获得足量的靶DNA，并且他可通过降低非特异性产物的扩增显著改进靶序列的特异性。

4.3、实时定量PCR法原理
实时定量PCR法是一种变异的PCR技术，旨在扩增并且同时定量靶DNA分子；他可进行检测和定量。

尽管实时定量PCR法的基本步骤衍生于普通的PCR法，但是其重要特点在于可在反应过程中实时检测扩增的DNA片段。

与传统的普通PCR（在反应的终末阶段检测PCR 产物）相比，这是一新的革命性的方法.实时检测PCR的两种常用方法如下：(1)用像SYBR Green这样的非特异性荧光染料嵌入任意双连DNA中（2）用像TapMan探针一样的序列特异的寡聚核苷酸探针标记荧光报告染料，只有该探针与互补的靶序列杂交后才能被检测到。

前者（SYBR Green）结合包括非特异性PCR产物（如引物二聚体）在内的所有双链DNA PCR 产物。

这是其潜在的缺陷，因为他会影响预期目标DNA的精确定量。

相比之下，像TapMan探针这样的荧光报告探针只检测包含互补探针序列的DNA片段；因此，即使出现非特异性的扩增片段，应用这类报告探针依然可以显著增强特异性并且能精确定量。

图1C所示为基于荧光探针技术(TaqMan PCR)的实时定量PCR的基本原理。

用荧光报
告染料（如FAM或VIC）在5‘端标记序列特异性寡聚核苷酸探针，在3’端标记共轭的淬灭染料（如TAMRA）。

荧光报告染料和淬灭染料非常接近，阻止荧光的发散。

当反应被启动时，在PCR退火阶段，探针和引物均与靶DNA序列退火。

当PCR反应继续时，Taq聚合酶的5‘-3’核酸外切酶活性使探针分解，进而使报告集团和淬灭集团分离，导致报告染料的非淬灭集团放射荧光，该荧光可在激光激发后得到检测。

因为荧光报告染料与淬灭染料的分离方式与PCR循环过程有关，所以荧光强度呈指数形式增加。

这种增加被用来测定Ct值，以计算每一次反应的扩增率。

最终可以精确测量主量DNA
最新的中枢神经系统结核的PCR诊断
5、检测M.Tb的商品化NAA法
如今，美国食品药品管理局（FDA）已通过了两中可行的商品化NAA法，用于M.Tb的直接检测。

如下：罗氏Amplicor结核分枝杆菌测试(Roche Diagnostic Systems, Inc., Indianapolis, IN, USA)和基因探针扩增结核分枝杆菌直接(MTD)检测(Gene-Probe, Inc., San Diego, CA, USA)两种检测均用M.Tb(GenBank accession no. NC 000962.2 (1471846–1473382))的16S核糖体RNA(rRNA)作为扩增的靶序列。

16S核糖体RNA(rRNA)代表着微生物的稳定属性，被广泛应用于确定分枝杆菌种类。

罗氏Amplicor检测应用的是普通PCR法。

在这种检测试剂盒中用引物对和M.Tb特异性的16S 核糖体RNA(rRNA)进行扩增和检测。

此外，罗氏Cobas TaqMan MTB检测是Amplicor检测的改进方法，它采用的是实时(TaqMan)PCR技术。

同时，基因探针扩增结核分枝杆菌直接(MTD)检测是等温的RNA扩增方法。

在这种检测试剂盒中，在恒温(43◦C)条件下通过反转录酶和RNA聚合酶耦合，使M.Tb的16S核糖体RNA(rRNA)直接扩增，用特异性oligo-RNA探针杂交方法进行检测。

现在，FDA规定Amplicor法只能用于痰涂片阳性的呼吸道标本的检测。

同时，不管AFB的痰涂片结果如何，均可应用MTD法检测呼吸道标本。

有几项研究报道，在AFB 痰涂片阳性标本中，两种检测方法均可获得满意的结果（敏感性和特异性均高于95%），但是，应用于AFB痰涂片阴性标本时，敏感性降低(60 -85%)。

FDA规定，两种方法均不能应用于CSF的检测。

6、PCR技术的临床应用：CNS结核的诊断
表1总结了用PCR技术诊断CNS结核的效果。

应用NAA技术的难点在于CSF标本中M.Tb 的快速诊断，CSF标本多数来自主要出现在TBM中的少数杆菌，还有CSF中扩增抑制因子的出现。

在临床实际实践中，诊断CNS结核时，PCR的敏感性和特异性是最为重要的。

为改进PCR法的敏感性和特异性，在CSF标本里从少数M.Tb杆菌中有效提取纯化DNA和设置特意有效的模版引物以扩增M.Tb DNA是最为重要的因素。

因此，许多研究人员在这些问题上进行着紧锣密鼓地工作。

在20世纪90年代，Shankar、Kaneko、Lin等人报道许多从CSF标本提取和纯化M.Tb DNA的改进方法。

据这些研究表明，用包含蛋白激酶K和十二烷基磺酸钠（SDS）的细胞溶解液作为表面活性剂处理CSF标本，然后从处理后的CSF标本中用氛-氯抽提法和乙醇沉淀法提取和纯化M.Tb DNA。

为更有效的从CSF样本中提取出少量的M.Tb DNA，作者用了高分子量载体Ethachinmate(Nippon Gene,Tokyo, Japan)和之前报道的氛氯抽提法和
乙醇共沉底法一起作为提取核酸的共沉底剂。

然而，在最近的研究中发现，在临床实验中，不适合用传统的氛氯抽提法和乙醇沉底法，因为这些方法步骤繁琐且非常耗时。

通常情况下，商用柱提取试剂盒（如QIAmp血包和QIAmp DNA Mini Kit，(Qiagen Inc., Valencia, CA, USA), Cobas Amplicor呼吸道标本制备试剂盒(Roche Diagnostic Systems, Inc., Indianapolis, IN, USA)）已经在之前的研究中被广泛用来从各种样本中提取DNA。

然而，在现行的研究中，商用柱提取试剂盒不能从CSF标本中提取出M.Tb DNA；因此，这些广为应用的试剂盒不适宜用来提取CSF标本中小量的M.Tb DNA。

当前，用NAA法评估了四种主要的M.Tb DNA特异性序列（即IS6110区插入序列(Rv3475:
GenBank accession no. NC 000962.2 (3891051–3892091)), 65-kDa热休克蛋白抗原(Rv0251c: NC 000962.2(302173–302652)), 16S rRNA基因和MPT64 (NC000962.2 (2223343–2224029))。

在这四种序列区域中，IS6110区插入序列是一个专门在M.Tb复合物基因组中发现的重复性元件，在许多研究中，他已广泛用于有优越扩增效率的靶序列(表1)。

在这些之前的研究中，针对IS6110插入序列的PCR检测用于TBM诊断是显示比较好的效果（总的敏感性为70–98%，特异性为80–100%）（表1）。

此外，靠近IS6110插入序列，16S rRNA基因常用于NAA检测，并且他是两个商用M.Tb检测方法（即Roche Amplicor检测和基因探针MTD检测）的靶序列。

如前所述，这两种方法检测呼吸道标本已经得到FDA认证。

现在尚无得到认证的用于CSF 检测的商用NAA方法，但是有研究评价了他们在TBM病例中的效果（表1）。

最近一项关于商用NAA法诊断TBM的荟萃分析显示总体的敏感性为56%，特异性为98%。

基于这些研究结果，人们认为商用NAA法可能在诊断TBM中起一定作用，但因其敏感性较低，所以不是确诊TBM的理想方法。

因为不能用这两种商用NAA法诊断TBM的主要原因在于其敏感性较差，所以可以认为，他们可以用于检测包含大量M.Tb杆菌的呼吸道标本，但不能用于检测CSF样本中的少量M.Tb DNA。

近来有研究表明，改进的基因探针MTD检测可提升CSF中M.Tb DNA的检测效果。

然而，这些改进技术的应用仅限于单个的实验室，尚未得到广泛应用。

同时，MPT64是编码MPT64蛋白的基因序列，这在M.Tb复合物中有特异性，且仅存在于M.Tb基因组中的一个位点上，因此，认为MPT64是PCR法中最具特异性的序列，已经在许多研究中用作PCR的靶序列。

Lee等人比较了IS6110, 65 kDa抗原和MPT64三个序列，认为MPT64是PCR M.Tb DNA扩增中最具特异性和敏感性的序列。

除了商用NAA法，应用PCR法扩增M.Tb DNA已经得到了许多临床上的关注（表1）。

正如上面所描述的一样，为了改进诊断CNS结核的PCR法，科研人员已经尝试了各种想法。

最近，发明了革命性的巢式PCR技术以诊断CNS结核，与传统的PCR相比，他能显著增加敏感性和特异性。

Liu等人报道，针对MPT64序列的巢式PCR被用于CSF标本的检测，这些标本来自临床怀疑感染TBM的21个患者，巢式PCR使得24小时内TBM诊断的敏感性为90%，特异性为100%。

此外，他们报道说，巢式PCR的敏感性比普通的PCR高1000倍。

作者从临床收集了9个高度怀疑TBM患者的CSF标本用巢式PCR法检测了MPT64序列。

在我们的研究中，巢式PCR的敏感性和特异性均为100%，但是普通PCR和M.Tb培养的敏感性仅为22.2%。

而且，我们检测了巢式PCR的最低检测敏感性。

巢式PCR的检测水平在1-10复制份数/2μL纯化的M.Tb DNA，与传统的PCR相比，其敏感性从1000倍提升到10000倍。

考虑到PCR分析结果和ATT反应之间的关系，Lin等人用普通PCR、Scarpellini等人用巢式PCR 分别检测了这种关系。

值得一提的是，Scarpellini等人进行了历时性研究，他们从接受临床治疗的7名患者中收集了一些CSF标本，用巢式PCR测定了IS6110序列。

在他们的研究中，巢式PCR结果显示4个TBM患者在ATT过程中的临床状况转阴。

与此相反，没有ATT反应
的3位患者整个临床过程中的巢式PCR结果依然为阳性，最终死亡。

因此，Scarpellini等人认为巢式PCR可用于评估TBM的临床治疗过程。

与此相似的是，在我们的研究中，从7个高度疑似TBM的患者收集ATT治疗中的27份CSF标本，用巢式PCR法进行检测，其中有11份(40.7%)显示阳性。

而且，我们的巢式PCR结果显示，在ATT中6位患者的临床状况得到改善，结果转阴。

与此相反，从7位接受临床治疗的患者中收集27份连续标本，用传统的PCR和M.Tb培养法检测，结果显示为阴性。

巢式PCR有着优异的敏感度和特异性，是一种实用的方法。

有些疑难病例用普通的PCR法很难检测到M.Tb，而用巢式PCR却可以诊断，鉴于此，作者预测，如果该项技术得到合理的广泛临床应用，他将是精确快速诊断CNS结核最有效的工具。

尽管我们都期望在临床上能广泛应用巢式PCR法，但令人遗憾的是，现在还很少用于TBM的诊断。

存在的主要争议在于，该法步骤繁多，而且很费时，不适合在临床上作为常规检测手段。

此外，因该法显著增加了敏感性且需要额外的扩增步骤，所以，一般来说会很容易发生交叉污染。

当然，巢式PCR不适合对许多样本进行临床常规的甄别检查。

然而，即便可用其他简单方法检查诊断TBM，但是阴性结果并不能排除感染M.Tb的可能性，因此，用适宜的临床检测手段诊断TBM依然是一大难题。

在急性临床阶段，CNS结核需要的不是甄别性检测而是一个确定性的检查。

因此，如果将巢式PCR用于从TBM高度疑似患者中收集的明确适当的临床标本中，他应该是一项非常有用的技术。

最后，用巢式PCR诊断CNS 结核的另一难点在于他需要配备一个合适的实验室以应用这一精确的技术；就现实情况而言，在TBM高度流行区，常常没有这种条件。

这是CNS结核诊断中一个至关重要的问题，需要得到尽快解决。

7、用于CNS结核诊断的PCR技术的新进展
最近，为快速诊断CNS结核，作者开发了一种新型内控宽量程定量巢式实时PCR法（WR-QNRT-PCR），用于M.Tb DNA的检测。

该技术既有巢式PCR的强敏感性，又有实时定量(TaqMan)PCR的精确性。

（图2a）
在WR-QNRT-PCR中，需准备“野生”(W)和“新突变”(NM)两种原质粒，用来定量检测M.Tb DNA。

在W-质粒中将一个239个碱基对的MPT64基因片段插入到pCR 2.1载体中，作为标准模版（图2b）。

NM-质粒在W-质粒基础上进一步突变，在iWR-QNRT-PCR中作为一个新的内控“校准器”（图2b）。

在NM-质粒中，五个区中包含两对（内部和外部）正向和方向引物对，和一个TaqMan探针退货位点，用人工随机核酸置换这些位点（图2b）。

将人工随机核酸序列设置成与野生M.Tb MPT64序列核酸组成一致的序列。

制备四对特异性引物和两种特异性TaqMan探针，以备用于WR-QNRT-PCR中。

表2和图2b显示了这些引物和探针的序列和位置。

对野生M.Tb或W-质粒的MRT64序列来说，两对正向和反向引物（WF1 和WR1两个外部引物用于第一步，TqMn-WF2 和TqMn-WR2两个内部引物用于第二步）和TaqMan探针(TqMn-W-VIC)是特异的。

相比而言，对NM-质粒中用作新内控“校准器”的人工随机核酸来说，两对正向和反向引物（MF1 和MR1两外部引物及TqMn-MF2 和TqMn-MR2两内部引物对）和TaqMan探针(TqMn-M-FAM)是特异的。

这些引物和探针的核酸组成均设置成一样的，但是序列不同，是随机分布的（表2）。

因此，我们可以认为，这些引物和探针跟野生MPT64或NM-质粒的退火效率是相同的。

WR-QNRT-PCR法包含两步连续的PCR扩增，第一步为传统的普通PCR,第二步为实时。