毕赤酵母翻译

Glycoengineered(糖基化工程) 毕赤 pastoris(毕赤酵母) 中表达的重组单克隆抗体的纯
化工艺开发
摘要
一个强健的和可扩展的净化过程被开发快速从 glycoengineered 毕赤酵母发酵生成抗
体的纯度高、数量充足。

蛋白 A 亲和层析用于捕获从发酵液抗体。

PH 梯度洗脱已应
用到要防止抗体沉淀在低 pH 的蛋白 A 列。

从蛋白抗体色谱法所载一些产品的相关杂质，被劈重链、重链和轻链的 misassembling。

它也有一些处理相关的杂质，包括蛋
白 A 残留、 endotoxin(内毒素)、宿主细胞 DNA 和蛋白质。

Ph 值为 4.5-6.0 的最优氯化钠渐变阳离子交换色谱法有效去除这些产品和过程相关的杂质。

从 glycoengineered P.酵母抗体是其 heterotetramer 折叠、物理稳定性和约束力的亲和性的商业同行相媲美。

介绍单克隆抗体（Mab）正迅速成为关键产品的生物医药产业。

大多数商业治疗性抗体是原封 IgG 分子与 IgG1、 IgG2 正在共同的子类。

这些 IgGs 由调解抗原和效应器
函数之间的联系，在免疫过程中发挥中心作用。

对目标细胞的特异性抗原的 igg 抗体
可变域的绑定将抗体依赖的细胞毒作用 (ADCC) 及补体依赖性细胞毒性 (CDC) 定向杀
害的目标单元格。

ADCC 触发由交联体 Fc 域的 IgG 抗体（Fc(Rs)，尤其是 Fc (RI 和
Fc (制证机对免疫效应细胞。

可能调解 ADCC 效应细胞包括自然杀手细胞、巨噬细胞
和嗜中性粒细胞。

疾病预防控制中心是由补充组件 C1q 绑定到 IgG，触发蛋白水解的
级联，以激活补充 fc 功能区启动。

IgG 型抗体有两重链和两条轻链由分子内的二硫键形成 heterotetramer 在一起。

重链
是通过共价键固定在天冬酰胺 297 (Asn-297) 低聚糖的糖基化。

人免疫球蛋白的主要
N-聚糖复杂 biantennary (二分支的) 类型，有 '核心' heptasaccharide(七庚糖)，GlcNac2Man3GlcNac2，被称为 G0 在我们的工作和文学。

其他的糖分残留可能会附加到 '核心 ' 要进一步生成复杂 biantennary 宇辉结构，如 GalGlcNac2Man3GlcNac2 (G1)，Gal2GlcNac2Man3GlcNac2 (G2) Neu5Ac2Gal2GlcNac2Man3GlcNac2。

目前，治疗单克隆抗体是在哺乳动物细胞，主要是在中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞株生产的。

在哺乳动物细胞中生产的重组抗体的宇辉配置文件是主要是异类。

非均质性可以
变化广泛克隆克隆，是取决于生产和文化条件的模式。

抗体宇辉配置文件可以有重大
的影响 ADCC 和疾病预防控制中心。

Deglycosylated IgG 显示没有激活 ADCC 和疾病
预防控制中心的能力。

Rituximab(利妥昔单抗)，嵌合的人权小鼠人性化抗 CD20 单克
隆抗体，生产的 glycoengineered 毕赤酵母中有两个较高亲和力向 Fc （RIIIa 和更大
B 细胞耗竭效价比从 CHO 细胞生产的对应。

N-聚糖从治疗单克隆抗体在哺乳动物细胞中生产主要是 fucosylated(岩藻糖基化)，在这一个 fucose(岩藻糖) 残留物附加到主的
N-乙酰氨基葡萄糖残留。

它表明聚糖 fucosylation 影响 ADCC 和疾病预防控制中心的
功效。

例如，关于人类 IgG1 afucosylated 聚糖可以显著提高 IgG1 绑定到 Fc (制证机和增强 ADCC 功效，但并不影响绑定到 Fc (RI 或 C1q。

这些结果表明可能通过生成特定的抗体 glycoform 优化抗体介导的效应的功能。

酵母是一个广泛使用的重组蛋白表达系统。

但是，在野生型酵母生产的糖蛋白包含潜
在免疫原性高甘露糖类型限制为治疗蛋白和抗体生产的酵母表达系统使用的 N-聚糖。

在酵母中的抗体表达的另一个挑战是重型和轻型链要形成 heterotetramer 的程序集。

一般情况下，在酵母表达分泌的抗体是黑腹为主或重型和轻型链的单体。

此抗体大会
问题可能与有关降低效率的抗体可折叠、加工和分泌的酵母有高甘露糖时键入 N-聚糖。

人类糖基化的途径是入酵母体育中执行特定的人性化的 N-糖基化反应与高保真设计出来。

Glycoengineered 细胞株的 P.酵母中成功制造了重组蛋白和单克隆抗体与人性化
的 N-连接糖结构。

利妥昔单抗产生不同 glycoengineered 细胞株的 P.酵母中可以正确装配形成 heterotetramer 和从 CHO 细胞展示商业利妥昔单抗相同抗原结合的特点。

在哺乳动物细胞培养、蛋白 A 亲和层析是广泛用于纯化的第一步直接捕获单克隆抗体产品ph 值为中性。

通常从蛋白A 列在低pH 洗脱的产品包含过程和产品相关的杂质。

这一进程有关的杂质包括内毒素、浸的蛋白 A、宿主细胞蛋白质和 DNA。

该产品相
关的杂质主要是聚合和修剪单克隆抗体产品。

若要删除这些杂质，一般采用第二和第
三色谱的步骤，通常从色谱阳离子交换 (CEX)、阴离子交换色谱法 (AEX)、疏水层析(HIC)、疏水性充电感应色谱 (信息中心) 和羟基磷灰石色谱中选择。

在我们的研究从哺乳动物细胞培养的许多单克隆抗体纯化过程不工作好删除产品相关
的杂质从 P.酵母发酵。

我们以前用于蛋白 A 亲和层析和 HIC 苯基琼脂糖凝胶净化从glycoengineered P.酵母中少量的利妥昔单抗。

最近，规模较小，非优化的版本，本文介绍的方法用来净化小额从 glycoengineered P.酵母发酵的单克隆抗体。

人性化的反-HER2/东大受体 IgG1 单克隆抗体作为示例用于研究单克隆抗体生产的glycoengineered P.酵母。

一个强大且可扩展的分离纯化过程是由优化工艺条件为蛋白
A 和阳离子交换产物开发的。

这一进程有效去除产品的相关杂质和进程相关的残余蛋
白 A、宿主细胞 DNA 和内毒素的杂质。

克的高度纯净抗 HER2 人与生物圈方案很容
易被从 P.酵母发酵时支持生化特性和动物研究生成。

从 glycoengineered P.酵母中抗HER2 人与生物圈是可比较的与其对应商业 (曲妥珠单抗) 在 heterotetramer 折叠式、物理稳定性和亲和力的抗原，Fc 制作的 CHO 细胞 (RI C1q。

此外，抗 HER2 单克隆
抗体生产和在体育中酵母本身就是 afucosylated。

材料和方法材料精简蹄筋（80 —— 165 m 粒子大小），MabSelect 肯定（85 m 粒子大小）、源 30 多岁（30 m 粒子大小）、 GE 医疗集团 (热身赛的获得了Capto S （90 m 粒子大小）、 SP 琼脂糖凝胶高性能 (HP) （34 m 粒子大小）、
SP 琼脂糖凝胶快速流 (FF) （45 —— 165 m 粒子大小）、 XK26/40、 XK16/40 和
蓬乱 10/200 列、新泽西州、美国）。

波罗斯岛 50 HS （50 m 粒子大小）是从Perseptive 生物系统（美国马萨诸塞州弗雷明汉)。

化学品是从JT 贝克(菲利普斯堡，新泽西州，美国）或西格玛——奥尔德里奇 (圣路易斯，密苏里州，美国）。

所有
缓冲区被都筛选与 Nalgene 聚醚砜膜过滤器（0.2 m 孔隙大小）（罗切斯特，纽约州，美国)。

SARTOPORE 2 (0.8 + 0.45 m) 是从匠（哥廷根德国）。

矢量抗人 IgG-AlexaFluor488，pPICZA，PicoGreen 试剂和 4-甲基伞形酮磷酸 (4-MUP) 是从Invitrogen （美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）。

共轭链霉亲和——碱性磷酸酶 (AP) 是从栽 (麦迪逊，无线，美国)。

4 —— 20%招聘—— HCl 准备好凝胶和 Prestained —— SDS 标准（广泛范围）是从生物 Rad 实验室 (大力神，加利福尼亚州，美国）。

Fc (RI 是从 R&D 系统（美国明尼苏达明尼阿波利斯）。

人类 C1q 是从美国生物 (美
国马萨诸塞州斯旺普斯科特）。

从生物界 (美国马萨诸塞州剑桥) 是抗 C1q 多克隆抗体-AP 共轭。

根据前面所述的方法被建造单元格行和发酵抗HER2 人与生物圈P.酵母中表达细胞株。

简单地说，重型和轻型链基因被极量到 pPICZA 矢量，转换为 glycoengineered GFI5.0 应变。

单元格行是为人与生物圈方案表达效价和 N-糖基化配置文件转化的菌株筛选后选定的。

根据前面所述的方法进行了 15 和 40 L 生物反应器中的发酵。

发酵液是由15,800 g 30 min 离心法恢复和由 SARTOPORE 2 (0.8 + 0.45 m) 通过过滤澄清。

柱层析法与 ÄKTA 资源管理器 100 系统从 GE 医疗集团（美国新泽西州热身赛) 在室
温下进行了所有色谱试验。

流率被选为有 5 分钟的停留时间列，除非它具体表明。

紫
外线吸收的蛋白质进行了监测在 280 nm。

A 蛋白亲和层析，以确定蛋白结合能力为人与生物圈方案从 P.酵母发酵的色谱，精简
蹄筋 A MabSelect 确定列平衡 20 毫米招聘，ph 值 7.0 中五柱床体积 (CV) 和被加载
与发酵上清液，ph 值 7.0，要完全饱和的列绑定能力。

随后，列洗一次与 20 毫米招聘，ph 值 7.0，1 M 氯化钠（3 CV) 和弱酸线性梯度，降低 ph 值从 5.0 到 3.0 的
100 毫米柠檬酸钠或不 1 M 精氨酸 (10 CV)。

A280nm 高峰千里马在 pH 测量从 ÄKTA 资源管理器 100 系统出水中。

代表人与生物圈峰值的分数被汇集蛋白浓度测定。

蛋白 A 列绑定能力，（单克隆抗体每毫升树脂的流动速度肯定会有 5 分钟的列驻地时间量）被从蛋白的洗脱分数按照下列公式计算：结合能力 = VE X CE / VR VE，卷的
体统 (ml) ；CE、蛋白浓度在体统分数（mg/ml）；VR，蛋白 A 树脂 (毫升) 列中的
容量。

阳离子交换色谱法简化蹄筋纯净的抗 HER2 人与生物圈用于阳离子交换色谱法发展。

阳离子 exchangeresins 在蓬乱 10/200 (1 厘米身份× 19 厘米）平衡与 ph 值 4.5 醋
酸钠 25 毫米 (5 CV)、满载 45 毫克的 IgG1 ph 值为 4.5 和 pH 5.0 醋酸钠 25 毫米用
清水洗净 (2 CV) 之前色谱分离。

使用源 30 多岁的色谱分色，SP 琼脂糖凝胶高性能、Capto S 和波罗斯岛 50 HS 都在进行线性渐变从 0 到 300 mM 氯化钠 (10 CV) 醋酸钠25 毫米，在 ph 值 5.0，跟随由 500 毫米氯化钠 (3 CV) 相同的钠醋酸缓冲。

源 30S 色谱分离在从 0 到 300 mM 氯化钠的线性渐变进行（10 CV) 在 25 毫米无水
醋酸钠 ph 值为 4.5 和 5.0，分别为何；在 ph 值为 6.0 磷酸 12.5 毫米钠醋酸钠 12.5 m m。

后线性梯度洗脱，列不断洗脱以 500 毫米氯化钠（3 CV) 与相同 ph 值的缓冲
区中。

源 30 年代逐步渐变色谱法在 100 毫米执行与氯化钠 (3 CV)，125 毫米 (3 CV)，150 毫米 (3 CV），175 毫米 (3 CV)，300 毫米 (2 CV) 和 500 毫米（2 CV) 在 pH
5.0 醋酸钠 25 毫米。

制备型色谱运行精简蹄筋 A 树脂被装在一个 XK26/40 列 (2.6 厘米的身份证× 28 厘米）和被平均 20 毫米招聘 ph 7.0 （5 CV)。

列是加载与 7 L 发酵上清液，ph 值 7.0，洗后再用以下洗涤议定书》规定: (1) 20 毫米招聘 ph 值 7.0，1 M 氯化钠 (4 CV）；
(2) 20 毫米招聘，pH 7.0 （2 CV）；(3) 20 毫米招聘 ph 值 7.0，乙二胺四乙酸 10
毫米、 10 毫米小伙子们 (6 CV）；(4) 20 毫米招聘 pH 7.0 （4 CV)。

列然后被洗脱
用线性渐变从 ph 值降低 4.0 到 3.0 的 100 毫米柠檬酸钠 (3 CV) 随 pH 3.0 （5 CV)。

流动率是 21 毫升/分钟。

弱酸的分数被调整到与 1 米磷酸钠，二元，ph 值 8.9 pH 5.0。

分数表示 IgG1 高峰被汇集为下一步纯化。

源 30S 树脂被装在一个 XK26/40 列 (2.6 厘米的身份证× 28 厘米）和平衡与 ph 值4.5 醋酸钠 25 毫米 (5 CV)。

从简化蹄筋池用水稀释五倍抗 HER2 人与生物圈（电导
率 ~ 10 mS/cm)、调整到与 1 M 醋酸，pH 4.5 和列上，然后加载。

根据上述协议进
行了逐步渐变源 30S 色谱法。

流率是 10 毫升/分钟流量快速 SP 琼脂糖凝胶树脂被装
在一个 XK16/40 列 (1.6 厘米身份× 35 厘米）和平衡与缓冲区 A (5 CV)。

抗 HER2
来自源 30 多岁的人与生物圈是用缓冲区 A 稀释五倍和 SP 琼脂糖凝胶列上加载。

后缓冲区洗涤 (5 CV)，人与生物圈洗脱与 5 列从制订缓冲区 pH 6.0，150 mM 氯化钠，
0.01%吐 20 组氨酸 10 毫米）的简历。

馏分的高峰期是作为最终产品汇集、通过 0.2 m 聚醚砜膜过滤器过滤和菌存放在 4 ℃。

蛋白质浓度抗 HER2 单克隆抗体浓度由测量他在 280 1 厘米石英试管中的吸收毫微米
与紫外线分光光度计。

使用了 1.42 L g-1 厘米-1 从氨基酸序列计算的理论消光系数。

纯化的抗 HER2 人与生物圈方案被集中的物理稳定性分析和交换制订缓冲区中的缓冲区。

调整到 10 毫克/毫升制订缓冲区中的抗体并将其存储在不同温度下的 4、 25、
37 ℃。

它分析了每周的大小排除色谱 (SEC) 来确定聚合和退化为六个星期。

使用Zorbax GF-250 （4 m 粒子大小）列、 9.4 × 250 毫米 L7420 紫外探测器监测 280 的日立 D 7000 高效液相色谱法系统（日立，东京，日本）上进行了分析秒毫微米。

样本量是 90 l 和流动相是 100 毫米磷酸钠、 ph 值 6.8，150 mM 氯化钠 0.05%叠
氮化钠在 1.0 ml/min 的流量。

SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS ——页）和双向凝胶电泳 SDS ——根据具有修
改 4 的 Laemmli 方法进行×非减少样品缓冲 (250 毫米招聘，ph 值 6.8 8 %sds，
40 %v / v 甘油，0.4%溴酚蓝钠盐，100 毫米 N ethylmaleimide) 和 4 ×减少样品缓
冲 (250 毫米招聘，ph 值 6.8 8 %sds，40 %v / v 甘油，0.4%溴酚蓝钠盐20 %v / v
b-巯基乙醇）。

凝胶是沾满了 0.025%考马斯辉煌蓝 R 250 在 7 %v / v 醋酸
acid/40%v/v 甲醇和 destained 在 10 %v / v 乙酸 60 分钟。

双向电泳技术是由肯德里克实验室，Inc.（美国无线麦迪逊) 执行的标准格式。

简单地说，等电聚焦 (IEF) 在进行了用 2 %ph 值 3.5 —— 10 混合的 ampholines 玻璃管 4 L.PH 梯度情节确定与表面 pH 电极和六个国际盛事基金管凝胶（运行与缓冲区）。

原肌球蛋白等电点 pI，5.2）列入作为内部的标准样品。

从国际盛事基金管凝胶然后被
密封到 10%丙烯酰胺板凝胶运行 SDS 平板凝胶电泳的顶部。

丙烯酰胺板凝胶是沾上
考马斯亮蓝和之间的玻璃纸床单晒干。

蛋白质的 pI 是使用供应商提供的梯度情节的
ph 值确定的。

内毒素分析内毒素是使用由查尔斯河 Endosafe (美国马萨诸塞州威明顿) 提供的终点显色鲎试剂裂解液 (LAL) 方法确定的。

残余蛋白分析残余蛋白 A 确定所述与作了一些修改。

96 井过滤塔中捕获了一种标准和样品的蛋白涂有反蛋白多克隆抗体。

素抗蛋白多克隆抗体被添加到板上形成免疫复合物与捕获蛋白 A.复杂检测到与共轭链霉亲和 AP，其次是基板 4 MUP。

该产品由阅读与 360 进行激发荧光定量毫微米、排放在 485 nm。

通过使用 PicoGreen 试剂根据指令从 Invitrogen （美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）确定宿主细胞基因组 DNA 分析宿主细胞基因组 DNA。

N-连接糖分析 N-连接糖配置文件确定基质辅助激光解吸/电离 /-飞行时间质谱法测定（解吸电离质谱) 使用航海家号德™ BioSpectrometry ™工作站福斯特市，加利福尼
亚州，美国应用生物系统）如上文所述
具有约束力的测定抗原结合分析法使用 SKBR3 细胞 (美国类型文化收藏) 所述稍作修
改与执行。

人与生物圈方案——抗原复杂被斑斑 IgG AlexaFluor488 antihuman。

番石榴表示加上（番石榴技术、唐熙华，加利福尼亚州，美国）检测到荧光强度 (MFI) 的意思是利用励磁 488 nm 和排放在 525 nm。

C1q 结合分析法进行细微的修改与所述。

人与生物圈-C1q 复杂检测到与反 C1q 多克隆抗体-AP 共轭，其次是基板 4 MUP。

该产品通过阅读相对荧光单位 (所) 与励磁在 360 量化毫微米、排放在 485 nm。

Fc (RI 绑定测定方法进行了如上文所述。

结果和讨论 A 蛋白亲和色谱仪为抗 HER2 单克隆抗体纯化蛋白 A 亲和层析是单克隆抗体纯化的常用方法。

精简的蹄筋 A 专供抗体纯化直接从原油原料的膨胀的床吸附色谱法。

MabSelect 肯定是基因工程蛋白A 亲和树脂提高了碱稳定性为列再生和净化处理。

MabSelect 确定陈列野生型蛋白 A 树脂，包括 MabSelect Xtra 和 ProSep vA 超可比绑定的能力。

我们比较 P.酵母发酵液抗 HER2 单克隆抗体纯化的简化型蹄筋 A 和MabSelect 确定列绑定能力。

这两个列有类似绑定容量 30 毫克/毫升 (表 1)，这是用
纯化的人类 IgG 确定其绑定能力相媲美。

因此，我们使用两个列以捕获从 P.酵母发酵液抗 HER2 人与生物圈方案和评价其洗脱条件。

抗体是常规地洗脱从蛋白 A 亲和层析在低 ph 值 (3.0)。

然而，抗体稳定在低 ph 值(2.5 —— 3.5) 并不倾向于聚合。

洗脱缓冲液具有更高的 ph 值被用于减少聚合，导致不完整洗脱抗 HER2 单克隆抗体。

精氨酸已被作为一种替代的策略以提升洗脱的 ph 值，防止抗体蛋白 A 亲和层析中的聚合。

若要优化抗 HER2 单克隆抗体洗脱条件，我们比较蛋白 A 色谱与无洗脱 pH(5.0–3.0) 减少渐变中的精氨酸。

总结在表 1 中，在
A280nm 峰值千里马 pH 出现 pH3.3 流线型蹄筋 A 色谱中，在 pH 3.7 MabSelect 肯定色谱中时抗 HER2 人与生物圈方案通过从 100 毫米柠檬酸钠 pH 5.0 到 3.0 的线性渐
变降低洗脱从这两个列。

Ph 值最大值被转移了 3.7 精简蹄筋 A 色谱中，当 1 M 精氨
酸被列入。

超过 90%的人与生物圈被痊愈的蛋白 A 列中每个这些洗脱条件 (表 1)。

没有人与生物圈方案后洗脱树脂（未显示的数据）中检测到。

由洗脱用降低 ph 值线性渐变中存在 1 M 精氨酸防止抗体沉淀。

考虑到其低压力降在柱层析，我们选择了在规模向上分离纯化过程中使用精简蹄筋A 并执行没有精氨酸pH 梯度洗脱洗脱缓冲液中。

阳离子交换色谱法若要移除产品相关杂质 A 中蛋白纯化抗 HER2 人与生物圈方案从 P.酵母中，有一些产品相关的杂质的不同从观察到在其他表达系统中的杂质。

在评估不
同产物包括 CEX、 AEX、 HIC、信息中心和羟基磷灰石色谱之后, 我们发现那阳离子
交换色谱法可以执行好，除去这些杂质。

图 1A 比较阳离子交换色谱执行与 ph 值为
5.0 相同氯化钠线性梯度洗脱。

图谱的源 30 多岁，波罗斯岛 50 HS 和 SP 琼脂糖凝胶HP 所有表现良好峰值的决议。

然而，峰值决议 Capto S 色谱这可能是由于它的大颗粒大小，暗示源 30 多岁、波罗斯岛 50 HS 和 SP 琼脂糖凝胶 HP 能执行好，除去杂质
在消失了。

若要确定最佳 ph 值为氯化钠梯度洗脱，我们比较源 30S 图谱与氯化钠线性梯度不同
ph 值为 4.5、 5.0 和 6.0。

如图 1B 所示，ph 值为 4.5 和 5.0，但一些重叠在前两个
洗脱峰 ph 值为 6.0 有好的决议。

要发展容易放大净化过程，我们优化源 30S 色谱与
氯化钠梯度分离。

如图 1 所示，洗脱峰被好分开在不同浓度 NaCl 在 pH 5.0 醋酸钠
25 毫米。

图 1 描述了 SDS ——分析这些山峰中的样本。

第一次的洗脱峰在 100 mM 氯化钠所载 misassembled 重伤和抗HER2 单克隆抗体，其中的轻链组成重伤和重链，作为证实由 N-末端氨基酸序列（数据不会显示）。

第二次的洗脱峰在 125 毫米氯化
钠载完好无损抗 HER2 人与生物圈与几个产品相关的杂质。

小洗脱峰或以上 150 mM
氯化钠被 misassembled 单克隆抗体，其中的重链、劈重链和轻链的混合物组成。

这
些结果表明在蛋白质纯化的抗 HER2 人与生物圈方案从 glycoengineered P.酵母中，产品相关的杂质来自 misassembling 劈重链、重链和轻链。

阳离子交换色谱法在最优氯化钠梯度 ph 值为 4.5-6.0，可以有效去除这些杂质。

规模向上净化过程基于上述优化小柱纯化的条件，我们开发了强大且可扩展的纯化工
艺生产的高品质抗 HER2 人与生物圈方案从 10 到 40 L P.酵母发酵的克。

后经过发酵
上清液通过简化蹄筋 A 列，非特定绑定杂质被从列通过洗涤，和抗体以降低 ph 值 4.0 到 3.0 从梯度洗脱。

抗体池从靶点色谱法是以五折的量减少到 10 mS/cm 电导率用水
稀释，直接应用到源 30 列若要移除产品相关的杂质。

抗体被洗脱 ph 值为 5.0 使用逐步氯化钠渐变。

最后，从源 30 列抗体是应用于 SP 琼脂糖凝胶快速流动的列和洗脱与制订缓冲区作为最终产品。

此分离纯化过程消除了耗费时间缓冲区交换过程之间每个
色谱法步骤，可能会引入蛋白质降解和聚合。

图 2A 显示 SDS ——分析的每一步纯
化过程中的抗 HER2 单克隆抗体产品和其商业对应产品，曲妥珠单抗在 CHO 细胞生产。

数据表明我们两步纯化过程可以产生抗 HER2 人与生物圈方案从 P.酵母发酵和实现曲
妥珠单抗作为同一纯度。

此分离纯化过程一般被用来净化其他 IgG1、 IgG2 和 IgG4
的单克隆抗体，针对不同的抗原。

图 2B 是其他三个代表性 mAbs 从 glycoengineered P.酵母中的 SDS ——分析和演示产品的高效去除相关杂质，达到纯度高。

表 2 概述了抗 HER2 单克隆抗体纯化过程的结果。

所含的蛋白 A 纯化的抗 HER2 产品约 20%的产品相关杂质，完全被从完好的抗体产品源 30S 色谱法。

分离纯化过程表明生产最后抗 HER2 单克隆抗体产品的纯度为 99%，实现 60%的总体恢复从捕获的蛋
白 A 蛋白质。

抗 HER2 蛋白的单克隆抗体亲和层析所载 290 ppm 的残余蛋白 A，共同洗脱抗体从列。

源 30S 和 SP 琼脂糖凝胶色谱法后, 残余蛋白 A 500-fold 几乎减少了
到 0.6 ppm (表 2)，最终产品中。

蛋白 A 纯化抗 HER2 单克隆抗体了低水平的宿主细
胞 DNA （< 7 ppm) 和内毒素 (0.6 欧盟毫克)。

在最终产品中，宿主 DNA 进一步减少了超过 20 倍到 < 0.3 ppm 和内毒素 2 折减至 0.3 欧盟/毫克 (表 2)。

宿主细胞蛋白杂质，最终产品中的几乎没有检测到使用多克隆抗体内部免疫印迹法检测。

多克隆抗体
在兔用毕宿主细胞蛋白作为抗原（数据不会显示）提出。

通过使用秒来检测聚合或降解表征抗 HER2 单克隆抗体单克隆抗体抗 HER2 从glycoengineered P.酵母中的物理稳定性进行了评估。

抗 HER2 人与生物圈方案制订缓冲区中的被存储时 4、 25、 37 ℃，为期六个星期，没有大量的聚合或降解检测到由SEC 分析。

后在 37 ℃为 6 周（图 3A 和 B）存储检测到只有 0.3%的退化。

在并行
稳定研究中的另一个常用的配方缓冲区 pH 6.0，150 mM 氯化钠，0.01%吐 80 10 毫
米磷酸钠）反她单克隆抗体，退化的 0.7%和 0.3%的聚合被检测到后六个星期在 37 ℃的存储。

抗 HER2 单克隆抗体浓度也是不断的在同一时间段内（未显示的数据）。

这
些数据表明该抗 HER2 人与生物圈方案从 glycoengineered P.酵母中具有良好的物理稳定性在不同的温度。

曲妥珠单抗从 CHO 细胞和抗 HER2 人与生物圈方案从 glycoengineered P.酵母中的 N-连接糖配置文件被比较的 MALDITOF 女士（图 4A 和 B）。

曲妥珠单抗 N-聚糖包括主要 fucosylated G0 和 G1 结构。

N-聚糖单克隆抗体抗 HER2 从 glycoengineered P.酵母本身就是 afucosylated，主要包括 G0 和一些 G1 和 G2。

O-聚糖为抗 HER2 人与生物
圈方案从 glycoengineered P.酵母中检测到低水平（数据不会显示）。

曲妥珠单抗从 CHO 细胞和抗 HER2 人与生物圈方案从 glycoengineered P.酵母中还对双向电泳技术进行了分析。

这两种产品在同一位置迁移和了 7.7 实验 pI 值。

埃德曼降解的 N-末端氨基酸测序证实重型和轻型链 N-特米尼均保持不变。

多肽映射确认相同的氨基酸序列在这两个产品（数据不会显示）。

从 glycoengineered P.酵母中抗 HER2 单克隆抗体产品的特点是其绑定到抗原，Fc (RI 和C1q 与曲妥珠单抗。

这两种产品表明细胞表面表达的靶抗原 (图5A) 相同的亲和力。

他们也有类似的亲和力为 FccRI 和 C1q (图 5B 和 C)，这是符合前一份报告，afucosylation 有没有影响人与生物圈方案绑定到 Fc (RI 或 C1q。

结论 A 强大且可扩展的分离纯化过程已来高效地生产出大批量的抗 HER2 人与生物圈方案从 P.酵母发酵。

此外，与过程相关的杂质都从产品中删除。

从 glycoengineered P.酵母中抗 HER2 人与生物圈是可比较的与其商业 (曲妥珠单抗) 对应从 CHO 细胞与正
确 heterotetramer 折叠和物理稳定性好、类似亲和力对其抗原，Fc (RI 和 C1q。

Glycoengineered P.酵母细胞株，预计在治疗性抗体，极大地减少生产时间，同时提高宇辉均匀性和降低生产成本的制造中发挥着重要的作用。