细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）

细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）
细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）
外周⾎培养及染⾊体的识别 (2)
⽩⾎病⾻髓及外周⾎染⾊体 (7)
外周⾎细胞脆性位点检测技术 (9)
⼈⽺⽔细胞培养收获操作程序 (11)
绒⽑细胞培养和染⾊体分析 (13)
⾼分辨染⾊体操作⽅法和识别 (15)
GII式显带法 (21)
N式显带法 (21)
R(反式)显带法 (23)
姐妹染⾊单体互换（SCE）技术 (23)
荧光原位杂交操作程序 (25)
附:细胞遗传学实验试剂配制标准操作规程（SOP） (27)
天平称量操作规程 (27)
药匙处理操作规程 (27)
PBS配制规程 (28)
胰酶配制规程 (28)
培养基配制规程 (29)
1N HCL配制规程 (29)
1N N A OH配制规程 (29)
外周⾎培养及染⾊体的识别
1. 原理：
外周⾎中的淋巴细胞⼏乎都是处在G
0期或G
1
期，⼀般情况下是不分裂的。

当在培养基
中加⼊植物⾎凝素（Phytohaemagglutinin PHA）时，这种⼩淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进⾏有丝分裂。

经过短期培养后，⽤秋⽔仙素处理就可获得⼤量中期分裂相的细胞，制⽚后可以清楚地对染⾊体进⾏观察与分析。

2. 外周⾎培养与收获操作步骤：
2.1 采⾎：⽤20:1肝素（0.4%）温润⽆菌注射器抽取外周⾎5ml（注意：消毒时需脱碘）。

2.2. 种⾎：将注射器搓捏，使⾎样混匀，在⽆菌条件下，⽤7号针头垂直种⾎0.3ml±抗凝⾎（成年男⼦28滴，成年⼥⼦30滴左右，⼉童32滴）⾄外周⾎培养基内。

2.3. 培养：将培养瓶放⼊37℃恒温箱中培养68-72⼩时，注意第⼆观察培养液有⽆凝⾎、溶⾎或长菌的现象，可每天培养液摇⼀摇，以便细胞可获得充分的营养，但⼀般情况下可不摇。

2.4. 制⽚过程：
2.4.1. 加秋⽔仙素：在培养完成前2-3⼩时，加⼊浓度为20ug/ml的秋⽔仙素2-3滴（7号针头竖滴）后，继续培养2-3⼩时。

2.4.2. 离⼼：将培养液⽤吸管吸⾄离⼼管中（100ml离⼼管）2000转/分×10分钟（Beckman 离⼼机）。

2.4.
3. 低渗液处理：弃上清，加⼊已预温⾄37℃的0.075mol/L氯化钾溶液约6-8ml，⽤吸管充分打匀，放⼊37℃⽔浴箱中，温育30分钟。

2.4.4. 预固定：即在离⼼管中加⼊现配的预温⾄37℃的甲醇、冰醋酸固定液（3:1）1ml 左右，轻轻混匀。

2.4.5. 再次离⼼：2000转/分×10分钟。

2.4.6. 第⼀次固定：弃上清，加⼊现配的预温⾄37℃的新配固定液约6-8ml，轻轻混匀，
然后2000转/分离⼼10分钟。

2.4.7. 第⼆次固定与第⼀次固定相同。

2.4.8. 制⽚：弃上清，⽤固定液将沉淀调成细胞悬液（⼀般不宜太浓）在冰⽚上滴⽚，⼀般⾼度为30cm±，每张⽚上滴2滴。

烤⽚：
2.5. 显带：先将玻⽚放在预温⾄37℃的0.025%胰酶溶液中（PH=7.2-7.4）消化1’30”左右，每次的作⽤时间并不完全相同。

可先试⼀张⽚⼦，再根据显带效果调整胰酶作⽤时间，再放在预温⾄37℃的0.85%NaCl溶液中漂洗两次，在预温⾄37℃的Giemsa溶液中染⾊10分钟，⾃来⽔冲洗⼲净，⽤吹风机吹⼲后，即可阅⽚。

3. 各号染⾊体的识别：各号染⾊体的界标和带型特征
A组染⾊体：包括1~3号染⾊体，其长度最长的1号和3号染⾊体的着丝粒约在1/2处，2号染⾊体的着丝粒约在3/8处。

1号染⾊体：着丝粒和次缢痕染⾊深。

短臂——近侧段和中段各有⼀条深带，其中段深带稍宽，在处理较好的标本上，远侧段可显出3～4条淡染的深带。

此臂分为3区，近侧的深带为2区1号带，中段深带为3区1号带。

长臂——次缢痕紧贴着丝粒，染⾊浓。

其远侧为⼀宽的浅带，中段和远侧段各有两条深带，以中段第2深带染⾊较浓，中段两条深带稍靠近。

此臂分为4个区，次缢痕远侧的浅带为2区1号带，中段第⼆深带为3区1号带，远侧段第三深带为4区1号带。

2号染⾊体：
短臂——可见4条深带，中等的两条深带稍靠近。

此臂分为两个区，中段第2、3深带之间的浅带为2区1号带，
长臂——可见6~7条深带，此臂分为3个区，第2和第3深带之间的浅带为2区1号带，第4和第5深带之间为3区1号带。

3号染⾊体：着丝粒染⾊浓。

在短臂和长臂的中段各有⼀条明显宽阔的浅带，是该染⾊体的特征。

短臂——⼀般在近侧段可见两条深带，远侧段可见3条深带，其中远侧段近端部的⼀条较窄，且着⾊较淡，这是区别3号染⾊体短臂的显著特征。

此臂分为2个区，中段浅带为2区1号带。

长臂——⼀般在近侧段和远侧段各有⼀条较宽的深带。

在处理较好的标本上，远侧段的
深带可分为三条深带，此臂分为两个区，中段浅带为2区1号带。

B组染⾊体：
4号染⾊体：
短臂——可见⼀条深带，短臂只有⼀个区。

长臂——可见均匀分布的四条深带，在处理⽐较好的标本上，在第2、3深带之间还可显出⼀条较窄的深带。

此臂分为3个区，近侧段第1、2深带之间的浅带为2区1号带；远侧段第3、4深带之间的浅带为3区1号带。

5号染⾊体：
短臂——可见1~2条深带，其远侧段的深带宽⽽且⾊浓。

此臂仅有1个区。

长臂——近侧段有两条深带，染⾊较浓，有时不显；中段可见三条深带，染⾊较浓；远侧段可见1~2条深带，近末端的⼀条着⾊较浓。

此臂分为3个区，中段第4深带为2区1号带；中段第5深带与远侧段第6深带之间的宽阔的浅带区为3区1号带。

C组染⾊体，包括6~12号和X染⾊体，中等长度，6、7、11号和X染⾊体着丝粒约在3/8处，其他号染⾊体的着丝粒约在1/4处。

6号染⾊体：着丝粒较浓。

短臂——中段有⼀条明显⽽宽阔的浅带，近侧段和远侧段各有⼀条深带，近侧段的深带紧贴着丝粒。

在处理好的标本上，远侧段的深带可分为两条，此臂分为2个区，中段的明显⽽宽阔的浅带为2区1号带。

长臂——可见五条深带，近侧的⼀条紧贴着丝粒。

远侧段末端的⼀条深带窄⽽且着⾊较淡。

此臂分为2个区，第2和第3深带之间的浅带为2区1号带。

7号染⾊体：着丝粒较浓。

短臂——有三条深带，中间的⼀条深带窄⽽且着⾊极淡，有时不明显，远侧近末端的深带着⾊浓⽽较宽，宛如“瓶盖”，这常常是辨别7号染⾊体的明显特征。

此臂分为2个区，远侧深带为2区1号带。

长臂——有三条明显的深带，远侧近末端的⼀条深带着⾊较淡。

第2和第3深带稍接近。

此臂分为三个区，近侧第1深带为2区1号带，中段的第2深带为3区1号带。

8号染⾊体：
短臂——有两条深带，其间有⼀条较明显的浅带，这是与10号染⾊体相区别的主要特征。

此臂分为2个区，中段浅带为2区1号带。

长臂——近侧段可见2~3条分界不明显的深带，远侧段有⼀条明显⽽恒定的深带。

此臂分为2区，中段深带为2区1号带。

9号染⾊体：着丝粒较浓。

短臂——近侧段可见两条深带，在有的标本上融合成⼀条深带。

此臂分为2个区，远侧的第1深带为2区1号带。

长臂——可见明显的两条深带，次缢痕⼀般不着⾊，在有些标本上呈现出特有的狭长的“颈部区”。

此臂分为3个区，进中段的⼀条深带为2区1号带，远侧段的⼀条深带为3区1号带。

10号染⾊体：着丝粒染⾊浓。

短臂——近中段有两条深带。

此臂只有⼀个区。

长臂——可见明显的三条深带，近侧的⼀条着⾊最浓。

该染⾊体长臂上的这三条明显的深带是与8号染⾊体相鉴别的⼀个主要特征。

此臂分为两个区，近侧段的第1深带为2区1号带。

11号染⾊体：着丝粒染⾊浓。

短臂——近中段可见⼀条宽的深带，在处理较好的标本上，这条深带可分为三条较窄的深带。

此臂只有1个区。

长臂——近侧有⼀条深带，紧贴着着丝粒，近中段可见⼀条明显的较宽的深带，在这条深带与近侧深带之间有⼀条宽阔的浅带。

在处理较好的标本上，进中段的这条较宽的深带可分成两条较窄的深带，两深带之间有⼀条很窄的浅带，后者虽常不明显，但却是分区上的⼀个界标。

在有些标本上近末端处尚可见⼀条窄的淡⾊的深带。

此臂分为2个区，界标即2区1号带为上述近中段两深带之间的那条很窄的浅带。

12号染⾊体：着丝粒较浓。

短臂——中段可见⼀条深带，此臂只有1个区。

长臂——近侧有⼀条深带紧贴着丝粒。

中段有⼀条宽的深带，这条深带与近侧深带之间有⼀条明显的浅带，但与11号染⾊体⽐较，这条浅带较窄，这是鉴别11号与12号染⾊体的⼀个主要特征。

在处理较好的标本上，中段这条较宽的深带可显出三条较窄的深带且正中的⼀条着⾊较浓。

在有些标本上，远侧段还可见1~2条窄的染⾊较淡的深带。

此臂分为2个区，中段正中着⾊较浓的深带为2区1号带。

X染⾊体：其长度介于7号与8号染⾊体之间。

着丝粒有时染⾊淡。

短臂——中段有⼀条明显的深带，宛如“⽵节状”。

在有些标本上其远侧还可见⼀条窄的、着⾊淡的深带。

此臂分为2个区，中段的深带为2区1号带。

长臂——可见四条深带，近侧的⼀条最明显。

此臂分为2个区，近侧的这条最明显的深带为2区1号带。

D组染⾊体：包括13~15号染⾊体，具有近端着丝粒和随体。

13号染⾊体：着丝粒和短臂染⾊深。

长臂——可见四条深带，第1和第4深带较窄、染⾊较淡；第2和第3深带较宽、染⾊较浓。

此臂分为3个区，第2深带为2区1号带，第3深带为3区1号带。

14号染⾊体：着丝粒和短臂染⾊深。

长臂——近中段和远侧段各有⼀条较明显的深带。

在处理较好的标本上其近侧可显出⼀条深带，其中段可显出⼀条着⾊较淡的深带。

此臂分为3个区，近侧第2条深带为2区1号带，远侧第4深带为3区1号带。

15号染⾊体：
长臂——中段有⼀条明显的深带，染⾊较浓。

在有的标本上其近侧段可见1~2条淡染的深带。

此臂分为2个区，中段深带为2区1号带。

E组染⾊体：包括16~18号染⾊体。

16号染⾊体着丝粒位置变化较⼤，17~18号染⾊体着丝粒约在1/4处。

16号染⾊体：着丝粒及次缢痕染⾊浓。

短臂——中段有⼀条着⾊较淡的深带，在有的标本上可见两条深带。

此臂只有⼀个区。

长臂——除次缢痕外有两条深带，远侧段的⼀条有时不明显。

此臂分为2个区，中段深带为2区1号带。

17号染⾊体：着丝粒染⾊浓。

短臂——中段有⼀条深带。

此臂只有⼀个区。

长臂——远侧段可见⼀条深带，这条深带与着丝粒相连的深带之间为⼀明显⽽宽的浅带，此臂分为2个区，上述浅带为2区1号带。

18号染⾊体：
短臂——⼀般为浅带，此臂只有⼀个区。

长臂——近侧和远侧各有⼀条明显的浅带。

此臂分为2个区两深带之间的浅带为2区1号带。

F组染⾊体：包括19和20号染⾊体，着丝粒约在1/2处。

19号染⾊体：
着丝粒及其周围为深带，其余均为浅带。

在有的标本上其长臂近中部可显出⼀条着⾊极
淡的深带。

短臂和长臂均只有⼀个区。

20号染⾊体：着丝粒染⾊浓。

短臂——有⼀长条明显的深带。

此臂只有⼀个区。

长臂——在远侧段可见1~2条染⾊较淡的深带，但有时不明显。

此臂只有⼀个区。

G组染⾊体：包括21号、22号和Y染⾊体，是染⾊体组中最⼩的具近端着丝粒染⾊体，21号和22号染⾊体具有随体。

21号染⾊体：着丝粒染⾊浓。

⽐22号染⾊体短，其长臂近着丝粒处有⼀明显宽的深带。

此臂分为2个区，其深带为2区1号带。

22号染⾊体：着丝粒染⾊较浓，⽐21号染⾊体长，在长臂上可见两条深带，近侧的⼀条着⾊浓⽽且紧贴着丝粒，呈点状，近中段的⼀条着⾊较淡，在有的标本上不显现。

此臂只有⼀个区。

Y染⾊体：长度变化⼤，有时整个长臂被染成深带，在处理较好的标本上可见两条深带，此臂只有⼀个区。

4. 实验⽤品：
超净⼯作台、酒精灯、烧杯、天平、低速离⼼机、恒温培养箱、冰盒、载玻⽚、玻⽚盒、光学显微镜、灭菌注射器（5 ml）、离⼼管、⽆菌吸管、量筒、培养瓶和试剂瓶等。

5. 实验试剂：
5.1. ⼈体外周⾎淋巴细胞培养基（RPMI-1640培养基购于湘南湘雅基因技术有限公司）
5.2. 秋⽔仙素(20 µg/ml)购于湘南湘雅基因技术有限公司
5.3. 0.075mol/l KCL
KCL 5.6 g
O 1000ml
DDH
2
O中完全溶解，常温保存备⽤。

将KCL倒⼊DDH
2
5.4. 卡诺固定液：甲醇和冰⼄酸按3:1⽐例混合，要现配现⽤。

⽩⾎病⾻髓及外周⾎染⾊体
1. 实验原理：
⾻髓染⾊体标本制备通常⽤于⾎液病患者，特别是慢性或急性粒细胞性⽩⾎
病，因为⾻髓反映粒系细胞增⽣情况。

在不受外界抗原的刺激下，通过短期培养和直接制⽚法可以观察到异常肿瘤细胞的核型。

反映那些病理淋巴细胞的染⾊体改变，为临床提供辅助诊断。

2. 实验步骤：
2.1. 常规抽取肝素抗凝⽩⾎病⼈外周⾎5ml或⾻髓2ml左右。

2.2. 马上送检，在⽆菌操作台上，取出3ml外周⾎或2ml⾻髓⼊⽆菌离⼼管中，加⼊RPMI 1640 5ml洗脱。

2.3. 1500rpm ×10min RT离⼼。

2.4. 去上清，再加⼊RPMI1640 5ml，混匀。

2.5. 1500rpm×10min RT离⼼。

2.6. 重复洗脱共三次，最后⼀次去上清，加⼊RPMI1640⾄洗脱前体积，混匀。

2.7. ⽤注射器抽取管中细胞液，常规接种，根据⾎象多少按梯度种⾎（⼀般为8滴、12滴、15滴、7号针头垂直竖滴）。

2.8. 接种后⼊37℃温箱培养，⼀般接种6瓶。

分别于24⼩时，48⼩时收获，收获前45-50min加秋⽔仙素0.4-0.8ug/ml。

2.9. 收获：启开培养瓶盖，将细胞液转⼊10ml离⼼管中。

2.10. 1500rpm×10min×RT离⼼。

2.11. 低渗处理：去上清，加⼊0.075M KCl 7ml,吸管⽤⼒吹打置37℃⽔浴中，低渗35-40min。

2.12. 预固定：加⼊甲醇：冰醋酸=3:1的固定液1吸管，约1.5ml，轻混匀。

2.1
3. 1500rpm×10min×RT离⼼。

2.14. 固定：去上清，加⼊3:1固定液8ml，轻混匀。

2.15. 1500rpm×10min×RT离⼼。

2.16. 去上清，重复固定两次。

2.17. 去上清，视沉淀多少加⼊⼏滴新鲜固定液。

2.18. 常规滴⽚于冰玻⽚上，1～2滴/张。

2.19. 75℃烤⽚3h。

2.20. 常规显G带。

2.21. 镜下分析
3. 注意事项：
⽩⾎病的染⾊体制作常受到以下3个因素的困扰：
标本有丝分裂指数低下或缺乏有丝分裂相；
染⾊体质量低劣，显带效果差；
复杂的染⾊体异常。

为尽量克服以上三点，应注意下⾯⼏项：
⽆论是⽩⾎病⾻髓标本还是外周⾎标本，均应及时送检；
洗脱是整个实验完成好坏的重要环节，⾻髓最好洗脱3次；外周⾎可适当减少1次；
采取24⼩时和48⼩时短期培养对于慢粒、急⾮淋等类型的⽩⾎病效果极佳，当24⼩时收获后发现效果不佳，在48⼩时可适当改变低渗时间，固定次数，悬液浓度和滴⽚张数等条件
当遇到已经过多次放疗，化疗和药物治疗的病⼈，重复两次标本都缺乏有丝分裂相，可能是病⼈本⾝原因造成的。

4. 实验器材及试剂
注射器、离⼼管、离⼼机、⽔浴箱、培养箱、显微镜、烤箱、载玻⽚、吸管、烧杯、计时器、量筒、染缸、肝素、RPMI 1640、⾻髓培养基、0.075MKCl、甲醇、冰醋酸、0.85% NaCl、Giemsa、胰酶、秋⽔仙素等。

外周⾎细胞脆性位点检测技术
1. 原理：
脆性部位是在⼀定的培养条件下，⼈类中期细胞染⾊体上的少数特异性位点恒定地表现出裂隙和断裂，并可导致缺失、⽆着丝粒短⽚和辐射图像及微粒的形成，裂隙⼀般不超过染⾊体的宽度，超过染⾊单体的宽度称之断裂。

脆性X综合征是指X染⾊体长臂27.3-28中某⼀⼩段DNA（CGG）碱基复制次数超过200次⽽引起的综合征，脆性（X）染⾊体并不是脆性X综合征的病因，⽽是该综合征的细胞遗传学标志。

2. 实验⽅法：
2.1. ⽅法1: ⽤胸苷合成酶抑制剂（Frdu）诱导的⽅法
2.1.1. 外周⾎接种于加有5%⼩⽜⾎清的Tc199培养基中，37℃培养72⼩时。

2.1.2. 加⼊0.05mmol/L Frdu继续培养17⼩时。

2.1.
3. 加⼊2.2mmol/L咖啡因，6⼩时后常规收获制⽚，显带处理。

2.2. ⽅法2同时显⽰脆性X和迟复制X染⾊体的⽅法
2.2.1. 取⼥性外周⾎0.5ml接种于5%⼩⽜⾎清的Tc199培养基中，37℃培养72⼩时。

2.2.2. 加⼊0.1mmol/L Frdu继续培养17⼩时。

2.2.
3. 于收获前5.5⼩时同时加⼊最终浓度为12mg/ml Brdu和2.2mmol/L咖啡因，
2.2.4. 常规收获制⽚，R带处理，在光镜下观察，可见LX和fra(x)(q27).
3. 显带观察：
G显带标本上3p14有脆性位点出现，说明培养体系成功，对于fra（X）应在G显带标本上确定fra（X）染⾊体即诊断为阳性，典型fra（X）家系，母亲为携带者，⼉⼦智⼒低下家族或有脆性X综合征临床表现时，如未发现fra（X）或发现有⼀个
fra（X）或发现有⼀个fra（X）时，应加⼤计数（成百增加）同时作相应的分⼦检查。

4. 注意事项：
4.1. 显带时间稍⽋⼀点易辨出脆性位点。

4.2. 注意⽆菌操作，严格执⾏⽆菌原则。

4.3. 阳性标准：在显微镜下，可见X染⾊体
4.4. 本实验⽅法为低叶酸培养双诱导的⽅法，⽐单纯的低叶酸培养效果好，提⾼了脆性X综合征的诊断效率。

5. 实验⽤品及试剂：
超净⼯作台、酒精灯、烧杯、天平、低速离⼼机、恒温培养箱、、⽔浴箱、载玻⽚、玻⽚盒、光学显微镜、灭菌注射器（5 ml）、离⼼管、⽆菌吸管、量筒、移液器、染液缸、镊⼦、计时器、2.2mmol/L咖啡因、0.05mmol/L Frdu 、0.1mmol/L Frdu、5%⼩⽜⾎清的Tc199培养基、12mg/ml Brdu。

⼈⽺⽔细胞培养收获操作程序
1. 原理：
⼈的⽺⽔细胞能长成单层并可连续进⾏传代培养，但它们的⼀些特征与⼀般成纤维细胞不同。

在⽺⽔中存在着各种不同类型的胎⼉细胞，依据其外形和⽣长特征可分为以下三类：上⽪细胞（E）、成纤维细胞（F）和⽺⽔细胞（AF）。

E细胞在胰酶消化的连续培养中不再⽣长，所以在培养过程中的⽣长期最短。

AF细胞在培养初期就长得很好，染⾊体分析⼤多⽤这类细胞。

F 细胞在培养中的⽣长期最长，在较⽼的⽺⽔培养物中占优势。

通常在培养后3~4天（可能更早些）即出现E细胞的集落，它们不适合做染⾊体分析。

⼤约在第7天出现的AF细胞可⽤于染⾊体制备。

如果在培养后第10天还未见长出新的细胞，就应考虑第2次⽺膜穿刺。

2. 操作步骤
1.在⽆菌条件下抽得妊娠18-24周⽺⽔后，注⼊10ml离⼼管中，⽴即送检。

2.进室后，以1500转/分室温离⼼10分钟。

3.进⽆菌室，在⽆菌操作台上吸去上清液，每管约留0.5ml，吸管打散细胞。

使成细胞悬
液，再加⼊约3.5ml吸管轻混匀，移⾄30ml⽅形掊养瓶中置37℃温箱⾏密闭式培养。

4.⼀般5天后镜下观察，可见成纤维样或上⽪样细胞⽣长，当细胞⽣长旺盛，在贴壁细胞
24-48h后，如细胞⽣长状况好，即可加⼊秋⽔仙素0.4-0.8ug/ml,4-6h左右⾏细胞学处理。

5.收获细胞：
5.1. 倒出瓶中细胞液⼊10ml离⼼管，0.85% NaCl冲洗细胞壁两遍。

5.2. 0.25% EDTA-trypin消化3-5分钟，待细胞⾯出现⾁眼可见皱形改变时即⽤吸管吹打下细胞。

5.3. 1500rpm分室温离⼼10min，去上清，约留0.5ml。

5.4. 低渗：加⼊0.075M KCl 4-6ml,吸管吹打。

37℃⽔浴3~5min。

5.5. 预固定：加⼊1.5ml ±甲醇：冰醋酸=3:1固定剂，轻混匀37℃⽔浴3min。

5.6. 1500rpm×10min，室温离⼼。

去上清约留0.5ml。

5.7. 固定：加⼊3:1固定剂8ml±，轻混匀，37℃⽔浴放15min。

5.8. 1500rpm×10’室温离⼼去上清，约留0.5ml。

5.9. 重复固定：同上。

5.10. 1500rpm×10’室温离⼼，去上清，约留0.5ml。

5.11. 视管底细胞量加⼊适当⼏滴固定剂。

5.12. 滴⽚：每⽚1-2滴。

5.13. 烤⽚：75℃烤箱烘烤3h。

5.14. 第⼆天⾏显带处理：同外周⾎。

3. 基本要求：
3.1. ⽺⽔标本应及时送检，送检过程中不宜受热或冰冻，实验⼈员收到⽺⽔后应先观察⽺⽔是否清亮，含胎脂的多少及颜⾊是否为⾎性⽺⽔。

3.2. 玻璃器⽫的清洗是⽺⽔培养成功与否的关键之⼀，万分之⼀的肥皂粉就可以导致细胞不贴壁，因此，清洗环节应严格把关。

3.3. 接种所⽤器⽫要进⾏严格的灭菌处理，⽆菌操作台应在接种前1-2h开启。

3.4. 离⼼时，⼀定要注意离⼼机内温度，必须达到室温⽅可离⼼。

3.5. 培养PH6.8±也是⽺⽔细胞普通密闭式培养成功的关键。

PH7以上不利于细胞贴壁。

3.6. 注意接种时培养基不能加得过多，卧倒瓶⼦时，培养基不能接触瓶塞。

3.7. 注意每天观察恒温箱的温度是否恒定，⽺⽔瓶凸⾯是否向下。

3.8. 要根据细胞的⽣长状况，来决定所要收获的时间，抓住细胞⽣长旺盛时期相当重要，如⽺⽔为⾎性⽺⽔或胎质较多须给予不同的处理。

3.9. 收获细胞时要掌握好低渗的时间及低渗液的量，吹打时⼒度要均匀，滴⽚浓度不能太⾼，以免细胞不分散。

3.10. 显带时，胰酶消化时间⼀般⽐外周⾎要稍长，但需根据其胰酶活性⽽定。

4. 注意事项：
4.1. ⽺⽔标本应及时送检，送检过程中不宜受热或冰冻，实验⼈员受到⽺⽔后应先观察⽺⽔是否清亮，含胎脂的多少及是否为⾎性⽺⽔；⽺⽔中少量红细胞不需处理，如有明显⾎性⽺⽔，⽴即在⽺⽔中加⼊⽆菌肝素⼀滴。

4.2. 接种所⽤器⽫要进⾏严格的灭菌处理。

4.3. 离⼼时，⼀定要注意离⼼机内温度，必须达到室温⽅可离⼼。

4.4. 培养及pH值为7.2~7.4也是⽺⽔细胞开放式培养成功的关键，⽽密闭培养的pH值为6.8~7.0。

4.5. 注意接种时培养基不能加的过多，卧倒瓶⼦时，培养基不能接触瓶盖。

4.6. ⽺⽔培养⾸先必须有好的培养基，传统的培养基是在F10中加⼊⼀定⽐例的胎⽜⾎清，由于营养成分较少，⽺⽔细胞培养所需时间较长，培养成功率低。

⽬前⼤多数实验室已经采⽤商业化培养基（必须具备三证），稳定且重复性好。

4.7. 要根据细胞的⽣长状况，来决定所要收获的时间。

抓住细胞⽣长旺盛时期相当重要，如⽺⽔为⾎性⽺⽔或太直较多需给予不同的处理。

要收获较多的分裂相，必须在适当的时机收获。

收获标准：于10倍⽬镜和4倍物镜下观察：a. 以梭长形⽺⽔细胞（AF细胞）为主要类型的⽣长细胞，形成的细胞克隆覆盖1个或1个以上的完整视野。

b. 培养瓶中有2~3个以上克隆细胞，且每个细胞克隆中存在有20个以上的圆形、双圆形或葡萄状透亮细胞。

c. 细胞克隆中央的细胞开始⽼化，克隆周边细胞⽣长旺盛。

4.8. 收获细胞时要掌握好低渗处理时间及低渗液的量，吹打时⼒度要均匀，滴⽚浓度不能太⾼，以免染⾊体不分散。

培养收获时间⼤多数为8~9天，最早收获在第7天，最长14天。

显带时，胰酶消化时间⼀般⽐外周⾎要稍短，但需根据其胰酶活性⽽定。

5. 实验⽤品：
培养箱、并和、载玻⽚、玻⽚盒、光学显微镜、灭酒精灯、烧杯、天平、离⼼机、CO
2
菌注射器（5ml）、⽆菌吸管、量筒、培养瓶，试剂瓶等。

6.实验试剂：
6.1. F10培养基和秋⽔仙素（20µg/ml）购于湘南湘雅基因技术有限公司。

6.2. 0.075mol/l KCL
O 1000ml
DDH
2
O中完全溶解，常温保存备⽤。

将KCL倒⼊DDH
2
6.3. 固定液
甲醇和冰⼄酸按3:1⽐例混合，要现配现⽤。

6.4. 0.25% EDTA-trypsin购于Specialty Media
6.5. ⽣理盐⽔，
绒⽑细胞培养和染⾊体分析
1. 原理：
绒⽑细胞由受精卵发育分化的滋养层细胞及绒⽑间质中的胚外中胚层细胞组成，绒⽑细胞与胎⼉组织同源，通过绒⽑检测，可客观反映胎⼉情况。

绒⽑既可以直接制⽚进⾏染⾊体的观察，也可以经培养制备染⾊体，进⾏产前诊断。

2. 操作⽅法：
2.1. 挑选孕6～8周孕妇，询问病史，进⾏妇科检查，以确定早孕，了解⼦宫⼤⼩，位置，弯曲情况及胚胎着床情况。

2.2. 拭去宫颈粘液，严密消毒宫颈及宫颈管下段，⼀般可不⽤宫颈钳，如⼦宫过度前屈或后屈，则有助⼿⽤宫颈钳轻拉⼦宫向下固定。

2.3. ⽤消毒塑料吸管按⼦宫的⾃然弯曲⽅向，沿着⼦宫壁轻轻进⼊⼦宫腔，直⾄有阻⼒感为⽌，⼀般进⼊⼦宫颈外⼝6-
10CM（根据妊娠天数及宫颈长度⽽定）切记反复进退，以防剥离⾯⼤，然后⽤空针抽吸，同时退出塑料管，⼤多吸出少许⾎液，绒⽑枝便夹在其中，将吸取物⽴即置于盛有⽆菌⽣理盐⽔反复冲洗数次以助其绒⽑与⾎液及蜕膜分离，然后送实验室培养或置4度冰箱中保存。

2.4. 培养及细胞学处理
2.4.1. 培养
在⽆菌条件下，⽤含过量的双抗的⽣理盐⽔反复冲洗绒⽑组织2-3次以去除⾎液，然后吸去并吸净⽣理盐⽔，经低倍镜下鉴定为绒⽑枝后，⽤眼科⼿术剪剪成1-2mm3⼩枝或⼩块，放⼊25cm2培养瓶中，分散于瓶的⼀边，于对侧加⼊含50%⾎清的培养基，PH为7.4，37度培养1～3⼩时待其贴壁后，即可翻瓶，使组织块泡在培养液中，每天观察，⼀般3-7天可见上⽪样或成纤维样细胞⽣长。

根据⽣长情况每隔5-7天换液⼀次。

2.4.2. ⼀般培养6-20天，待细胞⽣长旺盛时，按下列程序处理。

加⼊秋⽔仙素0.2-0.4ug/ml,让其过夜，约14⼩时左右，将培养液倒⼊离⼼管中，加⼊⽣理盐⽔2-3毫升，⽤弯头吸管将贴壁的细胞吹打下来，置离⼼管中以1200转/分离⼼10分钟，去除上清液，加0.075M氯化钾4ml吹打低渗，37C低渗15min；加3：1固定剂固定，离⼼，去上清液．加固定液，离⼼弃上清，如此反复固定3次，去固定液，轻轻混匀，滴⽚，句例滴3～5
张，75-80℃烤⽚3⼩时，⾃然泠后，常规和显带处理及进⾏染⾊体分析。

3. 注意事项
3.1. 在显微镜下鉴定绒⽑枝以及严格⽆菌操作是培养成功的关键。

3.2. 妊娠10周后平滑绒⽑膜逐渐退化，仅留下叶状绒⽑，逐渐发育成胎盘，因此
孕8周时进⾏取材，不但取材容易，且利于早期做出产前诊断。

3.3. 绒⽑⽣长最适宜的FH为7。

4。

⾼于⽇。

0和低于7．o均不适于绒⽑细胞⽣长。

3.4. 对绒⽑检杳结果有异常应复查⽺⽔或脐带⾎。

酒精灯，烧杯，天平，离⼼机，恒温培养箱，载玻⽚，玻⽚盒，光学显微镜，
灭菌注射器(5m1)，离⼼管，⽆菌吸管，量筒，培养瓶，试剂瓶，眼科镊，眼科剪，35nun⼀次性平⽫等。

5. 实验试剂
5.1. l00ml完全培养基：在超净⼯作台内，⽤移液管将培养基和其他各试剂分装
⼊100毫升⽆菌瓶中(商业化培养基或FI0培养基70mi，胎⽜⾎清30ml，双抗：青霉素和链霉素，终浓度为100U／m1，⽤3.5％碳酸氢钠调节pH为7.2~7.4)
5.2. 秋⽔仙素浓度：20llg／ml
5.3. 低渗液：0．075mol⼏的KCl溶液
5.4. 卡诺固定液
5.5. 0.25％EDTA—trypsin 购于Specialty Media
5.6. 双抗
5.7. ⽣理盐⽔
5.8. PBS
⾼分辨染⾊体操作⽅法和识别
1. 原理：
在正常情况下，⼊外周⾎中是没有分裂相的，只有在异常情况下才能发现。

植物⾎球凝集素(PHA)是⼈类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，在PHA作⽤下，原处于G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进⽽进⾏有丝分裂。

利⽤PHA这⼀特性，淋巴经过含有PHA培养液培养，在体外便可获得丰富的⽣长活跃、含有丝分裂细胞群，当细胞增殖到⼀定数量时，加⼊5—氟尿嘧啶和尿嘧啶核苷从⽽阻断DNA
的合成，将其同步在S期，17个⼩时后加⼊胸腺嘧啶核苷(TDR)释放细胞，使细胞有丝分裂继续，进⼊分裂期后加⼊染⾊体缩短抑制剂溴⼄锭(EB)，并加⼊秋⽔仙胺破坏纺缍丝的形成，从⽽阻⽌到较多具有550条带及850条带以上的分裂相，进⾏⼈类染⾊体⾼分辨分析。

2. ⽅法
2.1. 培养：外周⾎⽤含25%⼩⽜⾎清的RPMI1640培养基按常规培养72⼩时。

2.2. 停⽌DNA合成：加胸腺嘧啶核苷0.3mg/ml ,37℃培养17⼩时。

2.3. 洗涤：⽤RPMI1640液洗脱2次，以除去过量的胸腺嘧啶。

2.4. 孵育：加⼊含25%⼩⽜⾎清的RPMI1640培养基5ml，再置37℃培养5⼩时。

2.5. 停⽌有丝分裂：然后加放线菌素D 6µg/ml 60分钟，再加秋⽔仙胺0.4 ng/ml,10分钟后作细胞学处理。

2.6. 洗涤：将细胞液移⼊10ml的离⼼管中，以3000转/分离⼼10分钟，除去上清液。

2.7. 孵育：加⼊已预温37℃的0.4%氯化钾与0.4%柠檬酸钠1：1的混合液8ml，置37℃⽔浴（或温箱）中15分钟后。

2.8. 低渗处理：在离⼼前向低渗细胞液中加3：1的甲醇冰醋酸固定剂1ml，轻轻混匀后，以3000转/分离⼼10分钟，除去上清液。

2.9. 固定：加⼊固定剂8ml，30分钟后再换固定液（⾄少要更换2次固定液），以后每次离⼼均以3000转/分10分钟。

2.10. 制⽚：⼀般隔夜后制⽚，滴⽚前离⼼，吸尽上层固定剂，加⼊新固定剂8-10滴。

⽤吸管轻轻将细胞团打散成细胞悬液。

滴在预先⽤冰⽔冷却的载⽚上，每⽚滴1-2滴，⽴即将玻⽚在酒精灯上过⽕焰⼀次，不让其燃烧，再置70℃左右的烤箱中烘烤2-3⼩时，待⾃然冷却。

2.11. 显带：⽤已在37℃预温的⽣理盐⽔配成的0.025%胰酶溶液（pH7.4+）显带处理1-3分钟，Giemsa染⾊15分钟。

3. 各号染⾊体的识别。