雌马酚对糖尿病大鼠心肌内质网应激和细胞凋亡的影响

雌马酚对糖尿病大鼠心肌内质网应激和细胞凋亡的影响
白跳;迟丽屹;高宇勤;胡小菁
【摘要】目的探讨雌马酚对糖尿病心肌病大鼠心肌内质网应激和细胞凋亡的影响. 方法 24只8周龄雄性Wistar大鼠随机分为对照组,糖尿病组和雌马酚组,每组8只.对照组喂以普通饲料,糖尿病组和雌马酚组大鼠喂以高糖高脂饲料.饲养第56天(第8周),糖尿病组及雌马酚组大鼠分别腹腔注射链尿佐菌素45 mg/kg一次,制备糖尿病模型.此后,雌马酚组大鼠改为食用含0.1％雌马酚的高糖高脂饲料,糖尿病组和对照组大鼠继续饲喂原方案饲料.链尿佐菌素注射后第12周,测定体质量、血清甘油三酯和总胆固醇水平及空腹血糖,用Western blot蛋白检测法测定心肌GRP78、CHOP、ATF-6、活化caspase-3、Bax及Bcl-2表达水平. 结果与对照组比较,糖尿病组大鼠体质量显著下降,血清总胆固醇、空腹血糖水平明显升高(P＜0.05),血浆LDH、CK-MB、AST水平增高(P＜0.05),心肌内质网应激相关指标GRP78、CHOP、ATF-6显著升高(P＜0.05),且活化caspase-3蛋白和促凋亡蛋白Bax显著增高,抗凋亡蛋白Bcl-2减少(P＜0.05).与糖尿病组比较,雌马酚组大鼠体质量增加,血清总胆固醇、空腹血糖水平明显降低(P＜0.05),血浆心肌酶LDH、CK-MB、AST水平减少(P＜0.05),心肌内质网应激相关指标GRP78、CHOP、ATF-6显著减少(P＜0.05),且活化caspase-3蛋白和促凋亡蛋白Bax表达减少,抗凋亡蛋白Bcl-2表达增多(P＜0.05). 结论雌马酚可减轻糖尿病大鼠心肌内质网应激及细胞凋亡.
【期刊名称】《山西医科大学学报》
【年(卷),期】2018(049)008
【总页数】4页(P886-889)
【关键词】雌马酚;糖尿病;糖尿病心肌病;内质网应激;细胞凋亡
【作者】白跳;迟丽屹;高宇勤;胡小菁
【作者单位】西安市第九医院老年病一科,西安710054;解放军第四五一医院神经内科;西安市第九医院心血管内科;西安市第九医院心血管内科
【正文语种】中文
【中图分类】R541.8
糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy)是糖尿病患者常见的心脏并发症[1],其病理过程独立于冠心病、高血压和其他心血管疾病。

虽然糖尿病心肌病发病的机制尚不清楚,但心肌细胞凋亡已被证明在本病发展中起重要作用[1,2]。

心肌细胞凋亡可由不同机制引起,其中内质网应激依赖性细胞凋亡已得到证实[3,4]。

雌马酚(7-羟基-3-(49-羟基苯基)-苯并二氢吡喃)是大豆黄素的天然特异性代谢产物[5],已报道其具有心脏保护作用、抗癌作用等多种特性[6],但只有30%-50%的人能够在肠道中自体产生雌马酚[6]。

与雌马酚的前体大豆黄素相比,雌马酚具有更高的抗氧化活性和内质网亲和力[7]。

已有文献表明,雌马酚通过抑制内质网应激,缓解载脂蛋白E缺陷小鼠的动脉粥样硬化[8]。

因此,本研究拟探讨雌马酚对糖尿病心肌病大鼠心肌内质网应激和细胞凋亡的影响。

1 材料与方法
1.1 实验动物
8周龄雄性Wistar大鼠24只,SPF级,体质量200-250 g,由西安交通大学动物实验中心提供,动物许可证号:SYXK(陕)2016G006。

1.2 主要试剂
雌马酚购自南京恩明医药科技有限公司(批号:CB2317528),链脲佐菌素(STZ)购自美国sigma公司,GRP78抗体、C/EBP同源蛋白(CHOP)抗体和激活转录因子-
6(ATF-6)抗体购自美国Abcam公司,β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司,活化caspase-3抗体、总caspase-3、Bax、Bcl-2抗体购自美国Cell signaling technology公司,蛋白提取试剂盒和BCA蛋白浓度检测试剂盒购自碧云天生物公司。

1.3 实验分组及模型制备
将大鼠随机分为对照组糖尿病组和雌马酚组,每组各8只。

对照组采用普通饲料喂养,糖尿病组和雌马酚组大鼠以含10%猪油和20%蔗糖的高糖高脂饲料喂养,饲养
后第56天(第8周)腹腔按注射STZ 45 mg/kg(溶于枸橼酸钠缓冲液,pH 4.2)一次,对照组腹腔注射等量枸橼酸缓冲液[9]。

STZ注射后第72小时,断尾采血用拜安捷
血糖测定仪测定空腹血糖,以>11.6 mmol/L确定为糖尿病模型大鼠。

模型制备完
成后,雌马酚组大鼠改为食用含0.1%雌马酚的高糖高脂饲料,糖尿病组和对照组大
鼠继续按原方案进食[8]。

STZ注射后第12周,以2.5%戊巴比妥钠50 mg/kg处死大鼠,收集静脉血检测生化指标和心肌酶谱,取心脏组织用Western blot法检测相
应蛋白表达水平。

1.4 生化指标及心肌酶谱检测
经下腔静脉取血,测定空腹血糖并用全自动生化分析系统(OLYPUS AU2700)测定甘油三酯、总胆固醇及心肌酶肌酸磷酸激酶-MB同功酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平。

1.5 Western blot法蛋白检测
取心肌组织约200 mg，按照100 mg/ml的比例加入RIPA裂解液，液氮下充分
裂解，于4 ℃离心机中以12 500g离心15 min，取上清用BCA法检测蛋白浓度。

取蛋白行SDS-PAGE电泳并电转至PVDF膜上。

室温下5%脱脂牛奶封闭1 h后，
加入一抗(GRP78抗体1 ∶1 000；CHOP抗体1 ∶2 000；ATF-6抗体1 ∶1 000；β-actin抗体1 ∶500；活化caspase-3抗体1 ∶500；总caspase-3抗体1 ∶1 000；Bax抗体1 ∶1 000；Bcl-2抗体1 ∶1 000)，4 ℃孵育过夜。

次日加入山羊抗兔或者山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育1 h。

TBST缓冲液充分洗
涤后，行ECL显色，在凝胶成像系统中成像。

1.6 统计学分析
所有数据以均数±标准差表示,采用SPSS 17.0软件进行数据分析。

组间比较采用
单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。

P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 雌马酚对糖尿病大鼠代谢及生化指标的影响
与对照组比较,糖尿病组大鼠体质量显著下降,空腹血糖、总胆固醇(TG)水平显著升
高(P<0.05)。

与糖尿病组比较,雌马酚组大鼠体质量显著增加,空腹血糖和总胆固醇
明显降低(P<0.05)。

而三组大鼠血浆甘油三酯水平比较差异无统计学意义(P>0.05,见表1)。

2.2 雌马酚对糖尿病大鼠心肌酶谱的影响
与对照组比较,糖尿病组大鼠血浆心肌酶LDH、CK-MB、AST水平均增高(P<0.05,见表2),说明糖尿病组大鼠出现了明显的心肌损伤。

但与糖尿病组比较,雌马酚组大鼠血浆中LDH、CK-MB、AST水平显著降低(P<0.05,见表2)。

表1 雌马酚对糖尿病大鼠代谢及生化指标的影响Table 1 Effect of equol on body weight, blood glucose, total cholesterol and triglyceride in diabetic
组别体质量(g)空腹血糖(mmol/L)总胆固醇(mmol/L)甘油三酯(mmol/L)对照组406±555.3±0.71.21±0.280.91±0.12糖尿病组
191±42∗18.9±2.7∗1.59±0.13∗0.99±0.13雌马酚组
301±26#6.1±1.5#1.25±0.17#0.90±0.06
与对照组比较,*P<0.05;与糖尿病组比较,#P<0.05
表2 三组大鼠血浆心肌酶学检测结果的比较Table 2 Comparison of serum myocardial enzymes among three 组别 LDHCK-MB AST对照组
344±87649±78131±23糖尿病组629±89∗863±117∗289±56∗雌马酚组
507±56#661±51#156±31#
与对照组比较,*P<0.05;与糖尿病组比较,#P<0.05
2.3 雌马酚对心肌内质网应激相关指标GRP78、CHOP、ATF-6蛋白表达的影响与对照组比较,糖尿病组大鼠心肌内质网应激相关指标GRP78、CHOP、ATF-6的蛋白表达水平显著增多(P<0.05);而与糖尿病组比较,雌马酚组大鼠心肌GRP78、CHOP、ATF-6蛋白表达水平明显减少(P<0.05,见图1)。

2.4 雌马酚对心肌活化caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响
与对照组比较,糖尿病组大鼠心肌活化caspase-3、促凋亡蛋白Bax蛋白表达增多,而抗凋亡蛋白Bcl-2减少(P<0.05,见图2);而与糖尿病组比较,雌马酚组大鼠心肌活化caspase-3和Bax蛋白表达水平明显减少,而抗凋亡蛋白Bcl-2显著增多
(P<0.05,见图2)。

与对照组比较,*P<0.05;与糖尿病组比较,#P<0.05图1 雌马酚对心肌GRP78、CHOP、ATF-6蛋白表达的影响Figure 1 Effects of equol on the protein expression of GRP78, CHOP and ATF-6 in myocardium
与对照组比较,*P<0.05;与糖尿病组比较,#P<0.05图2 雌马酚对心肌活化caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响Figure 2 Effects of equol on the protein expression of activated caspase-3, Bax and Bcl-2 in myocardium 3 讨论
本研究采用高脂高糖饮食诱发胰岛素抵抗并单次注射链脲佐菌素(STZ)导致胰腺β细胞的部分功能失调的方法制备Ⅱ型糖尿病的大鼠动物模型[8,10]。

该方法处理的
大鼠出现了明显的高糖血症和高胆固醇血症,提示糖尿病模型构建成功。

本研究结
果显示,糖尿病组大鼠血浆心肌酶LDH、CK-MB、AST均较对照组显著增加,提示
糖尿病组大鼠心肌损伤出现。

而在食物中添加0.1%的雌马酚导致糖尿病大鼠血糖、总胆固醇和血浆心肌酶的下调,表明雌马酚可减轻糖尿病大鼠糖脂代谢异常和心肌
损伤。

内质网是分泌或跨膜蛋白折叠、钙储存和脂质合成的中心细胞器。

当内质网稳态破坏时,在其内腔中产生适应性信号传导途径激活,即内质网应激。

内质网应激已被证
实参与多种代谢疾病的发生和发展,包括Ⅱ型糖尿病、动脉粥样硬化等[11]。

GRP78是一种位于内质网内的钙离子结合分子伴侣,当细胞出现内质网应激时,细胞内会产生大量错误折叠或未折叠蛋白蓄积,GRP78会和内质网跨膜相关传感器蛋白(如ATF-6)分离,进而导致下游CHOP相关凋亡信号通路的激活[12]。

慢性病理性
内质网应激所导致心肌细胞损伤及细胞凋亡,是多种心血管疾病如糖尿病心肌病、
冠心病、高血压性心肌病、慢性心力衰竭的初始事件[13]。

与之一致,本研究结果
显示,糖尿病组大鼠心肌GRP78、ATF-6和CHOP表达较对照组显著增加。

而雌
马酚可明显减少心肌GRP78、ATF-6和CHOP的蛋白表达水平,说明雌马酚可缓
解糖尿病大鼠出现的内质网应激。

心肌细胞凋亡是在糖尿病心肌病中心肌功能障碍的重要机制[1,2,14]。

已有报道指出,糖尿病动物模型和患者中心肌细胞凋亡是导致心肌细胞损失、心肌重塑和功能
障碍的主要原因[1,15]。

本研究结果表明,雌马酚可减少糖尿病大鼠心肌凋亡相关分子活化caspase-3和Bax的表达,并增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,说明雌马酚可减轻糖尿病心肌病大鼠的心肌细胞凋亡。

而心肌细胞凋亡可由不同机制引起,如棕榈
酸毒性、自由基形成、内质网应激等。

其中内质网应激在心肌细胞凋亡中的作用已引起研究者的重视[3,4]。

已有证据表明雌马酚通过抑制内质网应激缓解载脂蛋白E 缺陷小鼠的内皮细胞凋亡[8]。

这就说明,雌马酚的抗心肌细胞凋亡作用可能与其减
轻内质网应激作用相关。

综上所述,雌马酚可能通过缓解糖尿病大鼠心肌内质网应激缓解心肌细胞凋亡,从而缓解糖尿病大鼠代谢功能异常和心肌损伤的发展。

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