肝硬化患者外周血单个核细胞中白蛋白mRNA的表达与病变进展的关系
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基金项 目： 广东 省 自然科 学基金 项 目（ 编号 ：５ ０ ９ ６ ００３０ ） 作 者单 位 ： １３ ７ 广州市 ． ５０ １ 广东省 第二人 民医院消 化内科
１３２ ＨＢ Ｎ 提 取 取 １０Ｉ ＿． ＶＤ Ａ ０ Ｌ血 清 加 入 等 量 ｘ Ｄ Ａ 提 取 液 。 匀 后 Ｉ０Ｃ 沸 １ ｎ 离 心 取 上 清 Ｎ 混 Ｏ ￣煮 ０ｍｉ， ２Ｉ Ｌ用 于 Ｐ Ｒ反 应 ｘ Ｃ １ ． 细胞总 Ｒ Ａ提取 单个核细胞 中加 入 １ Ｌ ．３ ３ Ｎ ｍ Ｔｉ ｌ Ｎ ｒ ｏＲ Ａ提取液 ，． ｍ 氯仿 ， ｚ ０２ Ｌ 漩涡振荡 ３ ． ０Ｓ室温 静 置 ５ｍｉ，２００ｒｍｎ 离 心 １ ｉ。 上 清加 入等 ｎ １ ０ ｉ， ／ ０ｍｎ 取 体积异丙醇 ， 室温静置 １ ｉ， ０ｍｎ 离心 ， 弃上清 。沉淀用 ７ ％乙醇 洗 涤 １ ． 恒 温 金属 浴 上 烘 干后 溶 于适 量 ５ 次 置 ＤＰ Ｅ Ｃ水 中 。取 １ 提 取 的 Ｒ Ａ溶 液 加 入 １ 脂 Ｎ ％琼 糖凝胶 中电泳 ， 观察条带 ， 以确保 Ｒ Ａ提取有效 。 Ｎ １３４ Ｈ ＶＤ Ａ检 测 采 用 实 时 荧 光 定 量 Ｐ Ｒ检 ．． Ｂ Ｎ Ｃ 测慢性肝炎患者血清 中 Ｈ Ｖ Ｄ Ａ含量 ， Ｂ Ｎ 具体操作按 说明书。 １３５ ｃ Ｎ 合 成 反 应 １ ｏ／ Ｎ Ｐ２ Ｉ ５× ．． ＤＡ ０ｍｍ ｌＬｄ Ｔ Ｌ． ｘ Ｒ Ｔ缓 冲液 ５ｔ Ｏ ｉ （Ｔ） ８０５ｔ ， Ｎ ｓ ５Ｕ， Ｌ， ｌ ｏ ｄ １ ． ｘ Ｒ Ａ ｉ ２ ｘ ｇ ｇ ｎ ＭＭＬ Ｖ逆 转 录酶 ２ ０Ｕ， Ｎ Ｌ ０ Ｒ Ａ２Ｉ 。用 Ｄ Ｐ ｘ Ｅ Ｃ水 补 充 至 总 体 积 ２ 。 ３ ℃ １ｈ ９ ℃ ３ｍｎ ｅ Ｎ 置 ４ ５ ７ ，４ ｉ，Ｄ Ａ ℃
胞 中的白蛋 白 ｍ Ｎ Ｒ Ａ阳性率差异有显著性 （ Ｐ＜０叭） ． 。结论 ： Ｖ Ｄ Ａ与肝硬化 患者肝脏病 变进 程密切相关 ， ＨＢ Ｎ 外 周血单个核 细胞 中的白蛋白 ｍＲ Ａ表达 与肝脏损 害相 关 ， 者可作 为肝 硬化病情进展的评价指标 。 Ｎ 二 关键 词 肝硬 化 单核 细胞 ＨＢ Ｎ 白蛋 白ｍＲ Ａ ＶＤ Ａ Ｎ
１ 资 料 组 患 者 来 自 ２０ ． ０ ５年 ７月 至 ２０ ０７年 ｌ 本 院 消 化 内科 收 治 的肝 硬 化 患 者 。 ３ ０月 ７ 例患者 中． １ ２ 例为代偿 性肝硬化 患者 ．６例为失代 １ 偿 性 肝 硬 化 患 者 。其 中 ． ２ 男 ６例 ， 龄 为 （４±１ ） 年 ４ ３ 岁； ｌ例 ， 女 １ 年龄为 （７ １ 岁。 ３ ±１ ） 肝硬化包括失代偿 期诊断标准按 照中华 医学会传染 病与寄生虫病 学分 会、 肝病 学分会 ２０ ００年西安会议 联合修 订的病 毒肝 炎防治方案和有关 文献 『引 ｌ 。所 有病例 血清 甲 、 、 ＿ 丙 戊、 庚型肝炎病毒均为阴性 。 １ ． 主 要 试 剂 Ｔｉ ｌ Ｎ 提 取 液 为 基 因 公 司 产 ２ ｒｏ Ｒ Ａ ｚ 品 。ＭＭ Ｖ逆 转 录 酶 、 ｌ ｏ ｄ ） ８ ｄ Ｔ 、 Ｎ ｓ Ｌ Ｏ ｉ （ Ｔ １ 、Ｎ Ｐ Ｒ Ａ ｉ ｇ ｎ和 Ｔｑ酶 购 白天 象 隆 公 司产 品 。Ｆｅｌ淋 巴 细胞 分 离 液 ａ ｉ ｌ ｏ 为 天津 灏 洋 公 司 。ＨＢ Ｄ Ａ定 量检 测试 剂 盒 购 自达 Ｖ Ｎ 安 生物 技 术 有 限公 司 。 甲 、 、 型 肝 炎 血 清标 志 物 乙 丙 检测试剂盒 由厦 门新创公司提供 ． 、 戊 庚型肝炎病毒 抗体检测试剂盒 由北京 贝尔公 司提供 。 Ｉ 方 法 ． ３ １ ． 标本采集 空腹采集慢性 乙型肝炎患者不抗 －１ ３ 凝 静 脉 血 和枸 橼 酸钠 抗 凝 血各 ２ｍＬ ，不 抗 凝 血 分 离 血清 ； 凝血 采用 淋 巴细胞 分离 液 梯度 离 心 分离 外 周 抗 血单个核细胞。 血清和单个核细胞置一 ０ ２ ％保存备用 。
实用 医学 杂志 ２ ０ ０ ８年 第 ２ ４卷第 ２ ２期
肝硬化患者外周血单个核细胞 中白蛋 白 ｍ Ｎ ＲＡ 的表 达 与病 变 进展 的关 系
许 鸣 张 智 张 珍 李泽泳 李亚红 付延玉
摘 要 目的 ： 究肝硬化患者外周血单 个核 细胞 中白蛋 白 ｍ Ｎ 研 Ｒ Ａ表 达与病 变进展 的关 系。 方法： 用实时 采 荧光定量 Ｐ Ｒ检 测肝硬化 患者血清 中 Ｈ ＶＤ Ａ含 量。 用逆转 录巢式 Ｐ Ｒ分 别检 测代偿性 肝硬 化、 Ｃ Ｂ Ｎ 采 Ｃ 失代偿 性肝 硬 化和健康人 外周血单个核细胞 中白蛋 白 ｍＲ Ａ的表达 。结果 ： ７ Ｎ ３ 例肝硬 化 患者 中 ２ 例 为代 偿期 ，６例为 失代 １ １ 偿期 代偿期肝硬化 患者血 清 Ｈ Ｖ Ｄ Ａ阳性率为 ６ ％（４ ２ ）ＨＢ Ｎ Ｂ Ｎ ７ １／ １ ， Ｖ Ｄ Ａ含量 为（ ． ．）×１ ｏｉ ／ Ｌ 外 ４３±２１ ０ ｃｐ ｓ ｍ ； ｅ 周血 单个核 细胞 白蛋 白 ｍＲ Ａ 阳性 率为 １％（／ １ 。失代偿 期肝硬 化 患者 血清 Ｈ Ｖ Ｄ Ａ阳性 率为 ８ ％（４ Ｎ ４ ３２ ） Ｂ Ｎ ８ １／ １ ） Ｈ ＶＤ Ａ含量 为（． ±３４ ×１ ｏｉｓｍ ；外周血单个核 细胞 白蛋 白 ｍＲ Ａ 阳性率 为 ５ ％（／ ６ 。２ ６ ． Ｂ Ｎ ５１ ．） ０ ｃｐｅ／ Ｌ Ｎ ６ ９ １ ） ０例 健康人外周血单个核 细胞 中的白蛋 白 ｍＲ Ａ 阳性 率为 ５ １２ ） 肝硬 化代偿期和 失代偿期 患者外周血单个核细 Ｎ ％（／ ｏ 。
慢 性 乙 型 肝 炎 患 者 肝 脏 ｔ Ｖ 反 复 活 动 的 长 期 ｑ Ｂ 转 归将 导致 肝 脏纤 维 化 ， 至 发 展 为肝 癌 。 硬 化病 甚 肝
变程度判断主要依靠肝脏生化 和肝脏 活检组织病理 学检查。但肝活检可 出现感染 、 出血等不 良后 果 ， 限 制 了其广泛 的临床应用 。 本研究通过检测 ３ 例肝硬 ７ 化 患 者 血 清 ＨＢ Ｎ 和外 周 血 单 个 核 细 胞 中 白 蛋 ＶＤ Ａ 白ｍ Ｎ Ｒ Ａ表 达 ．探 讨 ＨＢ Ｎ 与肝 炎 病 变 转 归 以 ＶＤ Ａ 及外周血 白蛋 白 ｍ Ｎ Ｒ Ａ表达与肝脏损害的关 系。
１３２ ＨＢ Ｎ 提 取 取 １０Ｉ ＿． ＶＤ Ａ ０ Ｌ血 清 加 入 等 量 ｘ Ｄ Ａ 提 取 液 。 匀 后 Ｉ０Ｃ 沸 １ ｎ 离 心 取 上 清 Ｎ 混 Ｏ ￣煮 ０ｍｉ， ２Ｉ Ｌ用 于 Ｐ Ｒ反 应 ｘ Ｃ １ ． 细胞总 Ｒ Ａ提取 单个核细胞 中加 入 １ Ｌ ．３ ３ Ｎ ｍ Ｔｉ ｌ Ｎ ｒ ｏＲ Ａ提取液 ，． ｍ 氯仿 ， ｚ ０２ Ｌ 漩涡振荡 ３ ． ０Ｓ室温 静 置 ５ｍｉ，２００ｒｍｎ 离 心 １ ｉ。 上 清加 入等 ｎ １ ０ ｉ， ／ ０ｍｎ 取 体积异丙醇 ， 室温静置 １ ｉ， ０ｍｎ 离心 ， 弃上清 。沉淀用 ７ ％乙醇 洗 涤 １ ． 恒 温 金属 浴 上 烘 干后 溶 于适 量 ５ 次 置 ＤＰ Ｅ Ｃ水 中 。取 １ 提 取 的 Ｒ Ａ溶 液 加 入 １ 脂 Ｎ ％琼 糖凝胶 中电泳 ， 观察条带 ， 以确保 Ｒ Ａ提取有效 。 Ｎ １３４ Ｈ ＶＤ Ａ检 测 采 用 实 时 荧 光 定 量 Ｐ Ｒ检 ．． Ｂ Ｎ Ｃ 测慢性肝炎患者血清 中 Ｈ Ｖ Ｄ Ａ含量 ， Ｂ Ｎ 具体操作按 说明书。 １３５ ｃ Ｎ 合 成 反 应 １ ｏ／ Ｎ Ｐ２ Ｉ ５× ．． ＤＡ ０ｍｍ ｌＬｄ Ｔ Ｌ． ｘ Ｒ Ｔ缓 冲液 ５ｔ Ｏ ｉ （Ｔ） ８０５ｔ ， Ｎ ｓ ５Ｕ， Ｌ， ｌ ｏ ｄ １ ． ｘ Ｒ Ａ ｉ ２ ｘ ｇ ｇ ｎ ＭＭＬ Ｖ逆 转 录酶 ２ ０Ｕ， Ｎ Ｌ ０ Ｒ Ａ２Ｉ 。用 Ｄ Ｐ ｘ Ｅ Ｃ水 补 充 至 总 体 积 ２ 。 ３ ℃ １ｈ ９ ℃ ３ｍｎ ｅ Ｎ 置 ４ ５ ７ ，４ ｉ，Ｄ Ａ ℃
胞 中的白蛋 白 ｍ Ｎ Ｒ Ａ阳性率差异有显著性 （ Ｐ＜０叭） ． 。结论 ： Ｖ Ｄ Ａ与肝硬化 患者肝脏病 变进 程密切相关 ， ＨＢ Ｎ 外 周血单个核 细胞 中的白蛋白 ｍＲ Ａ表达 与肝脏损 害相 关 ， 者可作 为肝 硬化病情进展的评价指标 。 Ｎ 二 关键 词 肝硬 化 单核 细胞 ＨＢ Ｎ 白蛋 白ｍＲ Ａ ＶＤ Ａ Ｎ
１ 资 料 组 患 者 来 自 ２０ ． ０ ５年 ７月 至 ２０ ０７年 ｌ 本 院 消 化 内科 收 治 的肝 硬 化 患 者 。 ３ ０月 ７ 例患者 中． １ ２ 例为代偿 性肝硬化 患者 ．６例为失代 １ 偿 性 肝 硬 化 患 者 。其 中 ． ２ 男 ６例 ， 龄 为 （４±１ ） 年 ４ ３ 岁； ｌ例 ， 女 １ 年龄为 （７ １ 岁。 ３ ±１ ） 肝硬化包括失代偿 期诊断标准按 照中华 医学会传染 病与寄生虫病 学分 会、 肝病 学分会 ２０ ００年西安会议 联合修 订的病 毒肝 炎防治方案和有关 文献 『引 ｌ 。所 有病例 血清 甲 、 、 ＿ 丙 戊、 庚型肝炎病毒均为阴性 。 １ ． 主 要 试 剂 Ｔｉ ｌ Ｎ 提 取 液 为 基 因 公 司 产 ２ ｒｏ Ｒ Ａ ｚ 品 。ＭＭ Ｖ逆 转 录 酶 、 ｌ ｏ ｄ ） ８ ｄ Ｔ 、 Ｎ ｓ Ｌ Ｏ ｉ （ Ｔ １ 、Ｎ Ｐ Ｒ Ａ ｉ ｇ ｎ和 Ｔｑ酶 购 白天 象 隆 公 司产 品 。Ｆｅｌ淋 巴 细胞 分 离 液 ａ ｉ ｌ ｏ 为 天津 灏 洋 公 司 。ＨＢ Ｄ Ａ定 量检 测试 剂 盒 购 自达 Ｖ Ｎ 安 生物 技 术 有 限公 司 。 甲 、 、 型 肝 炎 血 清标 志 物 乙 丙 检测试剂盒 由厦 门新创公司提供 ． 、 戊 庚型肝炎病毒 抗体检测试剂盒 由北京 贝尔公 司提供 。 Ｉ 方 法 ． ３ １ ． 标本采集 空腹采集慢性 乙型肝炎患者不抗 －１ ３ 凝 静 脉 血 和枸 橼 酸钠 抗 凝 血各 ２ｍＬ ，不 抗 凝 血 分 离 血清 ； 凝血 采用 淋 巴细胞 分离 液 梯度 离 心 分离 外 周 抗 血单个核细胞。 血清和单个核细胞置一 ０ ２ ％保存备用 。
实用 医学 杂志 ２ ０ ０ ８年 第 ２ ４卷第 ２ ２期
肝硬化患者外周血单个核细胞 中白蛋 白 ｍ Ｎ ＲＡ 的表 达 与病 变 进展 的关 系
许 鸣 张 智 张 珍 李泽泳 李亚红 付延玉
摘 要 目的 ： 究肝硬化患者外周血单 个核 细胞 中白蛋 白 ｍ Ｎ 研 Ｒ Ａ表 达与病 变进展 的关 系。 方法： 用实时 采 荧光定量 Ｐ Ｒ检 测肝硬化 患者血清 中 Ｈ ＶＤ Ａ含 量。 用逆转 录巢式 Ｐ Ｒ分 别检 测代偿性 肝硬 化、 Ｃ Ｂ Ｎ 采 Ｃ 失代偿 性肝 硬 化和健康人 外周血单个核细胞 中白蛋 白 ｍＲ Ａ的表达 。结果 ： ７ Ｎ ３ 例肝硬 化 患者 中 ２ 例 为代 偿期 ，６例为 失代 １ １ 偿期 代偿期肝硬化 患者血 清 Ｈ Ｖ Ｄ Ａ阳性率为 ６ ％（４ ２ ）ＨＢ Ｎ Ｂ Ｎ ７ １／ １ ， Ｖ Ｄ Ａ含量 为（ ． ．）×１ ｏｉ ／ Ｌ 外 ４３±２１ ０ ｃｐ ｓ ｍ ； ｅ 周血 单个核 细胞 白蛋 白 ｍＲ Ａ 阳性 率为 １％（／ １ 。失代偿 期肝硬 化 患者 血清 Ｈ Ｖ Ｄ Ａ阳性 率为 ８ ％（４ Ｎ ４ ３２ ） Ｂ Ｎ ８ １／ １ ） Ｈ ＶＤ Ａ含量 为（． ±３４ ×１ ｏｉｓｍ ；外周血单个核 细胞 白蛋 白 ｍＲ Ａ 阳性率 为 ５ ％（／ ６ 。２ ６ ． Ｂ Ｎ ５１ ．） ０ ｃｐｅ／ Ｌ Ｎ ６ ９ １ ） ０例 健康人外周血单个核 细胞 中的白蛋 白 ｍＲ Ａ 阳性 率为 ５ １２ ） 肝硬 化代偿期和 失代偿期 患者外周血单个核细 Ｎ ％（／ ｏ 。
慢 性 乙 型 肝 炎 患 者 肝 脏 ｔ Ｖ 反 复 活 动 的 长 期 ｑ Ｂ 转 归将 导致 肝 脏纤 维 化 ， 至 发 展 为肝 癌 。 硬 化病 甚 肝
变程度判断主要依靠肝脏生化 和肝脏 活检组织病理 学检查。但肝活检可 出现感染 、 出血等不 良后 果 ， 限 制 了其广泛 的临床应用 。 本研究通过检测 ３ 例肝硬 ７ 化 患 者 血 清 ＨＢ Ｎ 和外 周 血 单 个 核 细 胞 中 白 蛋 ＶＤ Ａ 白ｍ Ｎ Ｒ Ａ表 达 ．探 讨 ＨＢ Ｎ 与肝 炎 病 变 转 归 以 ＶＤ Ａ 及外周血 白蛋 白 ｍ Ｎ Ｒ Ａ表达与肝脏损害的关 系。