双氢青蒿素促胃癌细胞凋亡的作用

双氢青蒿素促胃癌细胞凋亡的作用
尤琪;张卉宁;黎昆东;张巨峰
【摘要】目的研究双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)对人胃癌细胞(SGC-7901、HGC-27)生长抑制和促凋亡的作用.方法用WST-1方法检测DHA处理后的胃癌细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况,细胞划痕实验检测细胞的迁移能力.结果不同浓度的DHA可以抑制胃癌细胞(SGC-7901、HGC-27)的增殖,且呈现浓度依赖性增长趋势.DHA作用48 h后,胃癌细胞的周期阻滞在S期,同时有诱导胃癌细胞凋亡的作用;DHA作用24 h和48 h后,对胃癌细胞的迁移能力有抑制作用.结论 DHA可有效地抑制胃癌细胞的增殖,并促进其凋亡.
【期刊名称】《广东药学院学报》
【年(卷),期】2016(032)004
【总页数】4页(P466-469)
【关键词】双氢青蒿素;胃癌细胞;细胞增殖;细胞凋亡
【作者】尤琪;张卉宁;黎昆东;张巨峰
【作者单位】广东药科大学中药学院广东广州510006;广东药科大学生命科学与生物制药学院,广东广州510006;广东药科大学生命科学与生物制药学院,广东广州510006;广东药科大学生命科学与生物制药学院,广东广州510006
【正文语种】中文
【中图分类】R735.2
根据2013年“全球癌症负担系列研究”统计的癌症数据显示，在中国，胃癌的发病率26.84%，死亡率23.55%，均高于全球水平，分别位居肿瘤发病率的第2位、死亡率的第3位［1］。

目前，治疗胃癌以手术并结合药物化疗为主，但较高的复发率以及化疗药物引起的并发症等缺点［2］，使多靶点治疗、毒副作用较小的中药及其单体成为潜在的抗肿瘤药物［3-4］。

青蒿素是中药植物青蒿中提取的环状倍半萜类化合物，具有良好的抗恶性疟疾作用，由于难溶于水，影响了其疗效的发挥，因此合成了抗疟效价高、速效、低毒的青蒿素衍生物——双氢青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）。

近年来发现，DHA对肝癌、宫颈癌、骨肉瘤等肿瘤细胞的生长有明显的抑制作用［5-8］，但关于胃癌细胞的研究尚未报道。

本实验以人胃癌细胞系作为研究对象，研究DHA抑制胃癌细胞增殖的作用，为中药抗肿瘤药物的开发提供依据。

1.1 主要试剂
双氢青蒿素（奥伦生物公司）；Opti-MEM培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（Life TechnologiesTM公司）；0.25%胰酶溶液（美国Technologies公司）；PBS磷酸缓冲液（美国ThermoFisher公司）；WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（碧云天公司）。

1.2 方法
1.2.1 WST-1实验取对数生长期的胃癌细胞，调整细胞的浓度为105/mL，取100 μL接种于96孔板。

细胞贴壁后，加入不同浓度的DHA（0.78、1.56、3.13、6.25、12.50 μmol/L），每个浓度设4个平行孔，继续培养48 h，每孔加入10
μL WST-1溶液，37℃继续培养3 h，测定450 nm处的各孔吸光值（A值）。

按照公式，抑制率=1-×100%，计算细胞增殖抑制率。

绘制以浓度为横坐标，抑
制率为纵坐标的细胞增殖抑制图。

1.2.2 流式细胞仪检测细胞周期采用PI染色法检测细胞周期，取胃癌细胞
3×105/孔接种于6孔板中，设未处理的胃癌细胞为对照组，经过DHA处理的作为处理组。

分别以DHA浓度为6.25 μmol/L的作用于SGC-7901细胞，浓度为1.56 μmol/L的作用于HGC-27细胞，经过48 h处理后，收集细胞，用PBS洗涤细胞3次，加入预冷的70%（φ）乙醇，4℃固定过夜，加入PBS洗涤2次，弃上清后每管加入PI工作液，混匀细胞，然后在室温下避光孵育30 min后上流式细胞仪检测。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡取胃癌细胞3× 105/孔接种于6孔板中，分别设置对照组和处理组，作用于细胞48 h后，收集细胞于流式管中，预冷的PBS洗涤2次，加入195 μL的Annexin V-FITC结合液，轻轻重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，室温避光孵育10～20 min，上流式细胞仪进行检测。

1.2.4 划痕实验用记号笔在6孔板背后用直尺均匀地划横线，每条线相隔约
0.5～1 cm，横穿过每孔。

其中每孔至少穿过5条线。

取对数生长期的胃癌细胞，调整细胞浓度3×105/mL，以每孔2 mL的接种量接种于6孔板中，培养24 h，加入DHA后分别培养24 h、48 h，在显微镜下观察细胞迁移情况。

采用软件Image-Pro Plus测量细胞划痕的距离，划痕愈合率=（0 h划痕宽度-12 h或24 h划痕宽度）/ 0 h划痕宽度×100%。

1.2.5 统计学处理使用SPSS12.0统计学软件，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 DHA对胃癌SGC-7901、HGC-27细胞增殖的抑制作用
与对照组相比，DHA能显著抑制胃癌细胞SGC-7901、HGC-27细胞的生长，且随着药物浓度的增加，具有明显的剂量依赖性（P＜0.05，P＜0.01）。

DHA对SGC-7901、HGC-27细胞的生长抑制曲线见图1、图2。

2.2 DHA对胃癌SGC-7901、HGC-27细胞周期的影响
与对照组相比，DHA作用48 h后，SGC-7901和HGC-27细胞的S期比例增加，分别增加了22.66%、9.03%，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。

结果表明，DHA可促使SGC-7901和 HGC-27细胞阻滞在S期。

见图3、4。

2.3 DHA对胃癌SGC-7901、HGC-27细胞凋亡的影响
经过48 h的DHA处理后，与对照组相比，SGC-7901细胞凋亡细胞增加了
7.59%，HGC-27细胞凋亡增加了12.65%，提示DHA对胃癌细胞具有明显的凋
亡作用（P＜0.01）。

2.4 DHA对胃癌SGC-7901、HGC-27细胞迁移的影响
与对照组相比，DHA分别作用24、48 h后，SGC-7901和HGC-27细胞的愈合速度明显变慢（P＜0.05）。

结果表明，DHA能明显降低SGC-7901和HGC-27
细胞迁移能力，见表1。

DHA是青蒿素类衍生物，被世界卫生组织推选为一线强效治疗恶性疟疾的药物，
近年来研究发现，DHA具有抗肿瘤、抗炎、增强免疫力等作用，特别在抗肿瘤的
作用中，具有多靶点、多通路、对正常细胞毒副作用小等优点［9-10］，为其临
床应用开发奠定了基础。

癌症发生的实质是细胞周期调控的紊乱，使机体细胞无间断的进入细胞周期，失去自主凋亡能力，恶性增殖失控的结果。

因此抑制胃癌细胞增殖，并促使细胞凋亡是治疗胃癌的重要方面。

本研究提示DHA可以明显抑制胃癌细胞的增殖，且呈浓度依赖性趋势，说明DHA对不同分化程度的胃癌细胞均具有抑制增殖的作用。

当DHA浓度为6.25 μmol/L时，中分化SGC-7901细胞的抑制率是44.07%，而低分化HGC-27细胞的抑制率达到了63.64%，提示不同分化程度的胃癌细胞对相
同浓度的DHA的敏感度也不同。

相关文献［14-17］表明，Bcl-2基因是一种原癌基因，其参与了胃癌细胞分化的
过程，在不同分化程度的胃癌组织中均高表达，且在高分化胃癌组织中的表达明显
高于低分化胃癌组织，从而提高了胃癌的发病率。

本实验中，DHA可以使胃癌细胞的周期进程阻滞在S期，并且诱导胃癌细胞出现凋亡现象，说明DHA可以通过延长细胞周期并促使细胞发生凋亡的方式，达到减缓细胞增殖的目的。

但DHA促使胃癌细胞凋亡的具体作用机制是否与调控Bcl-2蛋白表达有关还需进一步的深入研究。

【相关文献】
［1］FITZMAURICE C，DICKER D，PAIN A，et al.The global burden of cancer 2013［J］.JAMA Oncology，2015，1（4）: 505-527.
［2］王亚旭，毕德利.影响胃癌术后复发及预后的相关因素分析［J］.中国普通外科杂志，2011，20（4）:334-337.
［3］王亚坤，谢长生，楼金杰，等.中医药治疗胃癌的实验研究进展［J］.中华中医药学刊，2015，33（11）:2743-2745.
［4］王超，沈克平，胡兵.中药复方治疗胃癌实验研究进展［J］.中华中医药学刊，2014，32（9）:2243-2245.
［5］毛媛.双氢青蒿素对人肝癌HepG2细胞生长及Mcl-1和Caspase-3基因表达的影响［D］.
江西:南昌大学，2014.
［6］HU C J，ZHOU L，CAI Y.Dihydroartemisinin induces apoptosis of cervical cancer cells via upregulation of RKIP and downregulation of bcl-2［J］.Cancer Biol Ther，2014，15 （3）:279-288.
［7］LIU W，WANG D W，YU S Y，et al.The effect of dihydroartemisinin on the proliferation，metastasisand apoptosis of human osteosarcoma cells and its mechanism ［J］.J Biol Regul Homeost Agents，2015，29（2）:335-342.
［8］AN F F，LIU Y C，ZHANG W W，et al.Dihydroartemisinine enhances dictamnine-induced apoptosisvia a caspase dependent pathway in human lung adenocarcinoma
A549 cells［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2013，14（10）:5895-5900.
［9］汪溪，李建业，厦春咸.双氢青篙素抗肿瘤作用研究进展［J］.海南医学，2010，21（13）:119-121.
［10］邱淑敏，陈涛，刘美玲.中药诱导肿瘤细胞凋亡机制研究进展［J］.动物医学进展，2015，
36（1）:183-186.
［12］DU X X，LI Y J，WU C L，et al.Initiation of apoptosis，cell cycle arrest and autophagy of esophageal cancer cells by dihydroartemisinin［J］.Biomed Pharmacother，
2013，67 （5）:417-424.
［13］CHEN H，SUN B，WANG S，et al.Growth inhibitory effects of dihydroartemisinin on pancreatic cancer cells: involvement of cell cycle arrest and inactivation of nuclear factor-kappaB［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2010，136 （6）:897-903.
［14］聂明豪，李秀荣，杨彬，等.NF-kB和Bcl-2在胃癌组织中的表达及意义［J］.中外医疗，2010，33（5）:43-44.
［15］朱新勇，张同全，王福春，等.p53、bcl-2和nm23基因在胃癌组织中的表达及其临床意义［J］.中国普外基础与临床杂志，2003，10（6）:589-592.
［16］姚国栋.Bcl-2、bax基因与胃癌［J］.中国肿瘤，2003，12 （11）:36-38.
［17］朱瑞雪，时永全，张连峰.NDRG2和Bcl-2在胃癌组织中的表达及意义［J］.细胞与分子免疫学杂志，2015，31 （4）:516-519.。