高效液相色谱法测定莜麦米酒中γ-氨基丁酸

高效液相色谱法测定莜麦米酒中γ-氨基丁酸
刘文勃;易好诚;李苏红;徐杰;王俊伟;张雷
【摘要】建立紫外—高效液相色谱测定莜麦米酒中的γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid,GABA)含量的分析方法.利用碱性条件下,GABA可与邻苯二甲醛(OPA)发生衍生化反应,生成具有较强紫外吸收的衍生物.采用紫外—高效液相色谱仪检测,色谱条件:Eclipse XDB-C18分析柱(5μm,4.6×150 mm),以50 mmol/L 的乙酸钠(pH6.8)—甲醇—四氢呋喃(THF,A相,82∶ 17∶1；B相,22∶ 77∶1,V/V)为流动相进行梯度洗脱,可检测到GABA在0.04～0.5 g/L范围内与GABA峰面积的线性关系良好R2=0.9985,样品衍生时间1 min最佳,平均回收率为99.5％,精密度相对标准偏差(RSD)为1.6％,重复性(RSD)为0.66％,最低检出限为0.0254 g/L.方法简单快捷、重复性好、灵敏度高,可用于莜麦、莜麦发酵酒等中GABA含量测定.
【期刊名称】《粮油食品科技》
【年(卷),期】2013(021)001
【总页数】4页(P67-70)
【关键词】莜麦米酒;γ-氨基丁酸;紫外检测;高效液相色谱
【作者】刘文勃;易好诚;李苏红;徐杰;王俊伟;张雷
【作者单位】沈阳师范大学粮食学院,辽宁沈阳 110034;沈阳师范大学粮食学院,辽宁沈阳 110034;沈阳师范大学粮食学院,辽宁沈阳 110034;沈阳师范大学粮食学院,辽宁沈阳 110034;沈阳师范大学粮食学院,辽宁沈阳 110034;沈阳师范大学粮食学院,辽宁沈阳 110034
【正文语种】中文
【中图分类】TS207.3
γ－氨基丁酸(γ－Aminobutyric acid，简称GABA)是一种非蛋白质氨基酸，为哺乳动物中枢神经系统内重要的氨基酸类神经递质［1］，分布非常广泛，在动物、植物、微生物中均有GABA存在。

大量研究结果表明，GABA具有重要的生理功能，能增进脑活性和长期记忆、安神抗抑郁、美容润肤、改善脂质代谢、降血压、活化肝功能和改善更年期综合征等重要生理功能［2－3］。

莜麦是谷类食品中最好的全价营养食品之一，也是一种兼备食疗功能的作物。

其蛋白质、脂肪、维生素及钙、铁、磷等矿物质的含量在同类粮食作物中最高。

莜麦米酒具有香醇甘美，营养价值高，经济实惠等特点，老幼妇孺皆宜食用，有益身体健康。

经过发酵工艺加工的莜麦米酒其糠层纤维被软化和细微化，改善了莜麦产品口感，同时也大大提高了功能成分(如GABA)的含量。

因此，找到一种高效、简便、可靠的方法来测定莜麦米酒中GABA的含量，可为开发和评价富含GABA的功能性莜麦米酒及同类产品提供参考。

由于GABA对电化学和紫外、可见光及荧光的不灵敏性，导致采用直接方法对其
测定比较困难。

关于GABA的测定有薄层扫描法、氨基酸分析仪法［4］、色质联用法、蒸发光散射检测技术、纸电泳比色、高效离子交换色谱—积分脉冲安培检
测法、毛细管气相色谱法［5］、酶法［6］、毛细管电泳法［7］、高效液相色谱法［8－9］等。

其中大部分方法检测精度虽然高，但其设备比较昂贵、操作复杂、检出限低，且使用维护繁琐，不适用于大量的分析测定。

高效液相色谱法广泛应用于氨基酸浓度测定，具有分析迅速、灵敏度高、操作简单、便于保养维护等优点。

本研究的目的是建立一种邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生紫外—高效液相色谱检测莜麦
米酒中GABA的方法。

1 材料与方法
1.1 材料与仪器
材料:莜麦、“安琪”甜酒曲:市售。

试剂:γ－氨基丁酸(γ－Aminobutyric acid):纯度(%)≥99.0，上海求德生物化工有限公司;β－巯基乙醇:纯度(%)≥99.0，Amresco公司;邻苯二甲醛(OPA):化学纯，国药集团化学试剂有限公司;四氢呋喃(THF):色谱纯，天津博迪化工股份有限公司;甲醇 :色谱纯;硼酸:分析纯;无水乙酸钠:纯度(%)≥99.0;所用水均为超纯水。

仪器:KQ2500DB型数控超声波清洗器:昆山市超声波仪器有限公司;WFZUV－2000紫外可见分光光度计:尤尼柯仪器有限公司;Agilent Technologies 1200 series(包括Eclipse XDB–C18柱、G1311A四元泵、G1316A柱温箱、G1314A 可变波长检测器)，Agilent公司;D－37520型台式离心机，德国Heraeu Biofuge Stratos公司;津隆针筒式有机滤膜过滤器(0.22 μm、0.45 μm)。

1.2 色谱条件
色谱柱为Eclipse XDB～C18 5 μm，4.6×150 mm柱;流动相为50 mmol/L的乙酸钠(pH6.8)—甲醇—四氢呋喃(THF)(A 相，82∶17∶1;B 相，22∶77∶1，V ∕ V)［10］，各成分均用0.45 μm 滤膜过滤并经超声波脱气处理;柱温，27 ℃;流量，1.0 mL/min;进样量，10 μL;紫外检测波长326 nm。

本实验采用的梯度程序见表1。

表1 GABA梯度洗脱程序步骤时间/min∶THF A(82∶17∶1，V ∕ V，)，
B(22∶77∶1，V ∕ V)乙酸钠(pH6.8)∶甲醇1 0 95 5 2 6 88 12 3 9 66 34 4 22 30 70
1.3 样品制备
莜麦米酒按莜麦∶水=1∶2的比例，用20℃～25℃水浸24 h～48 h;用煮饭锅加
水蒸煮1 h左右;出锅后采用淋饭降温，冷却至饭温为30℃～35℃;加0.4%左右的酒曲，搅拌均匀，装入烧杯中，压实，在30℃下发酵96 h;将发酵后的酒液，用离心机以15 000 r/min离心10 min，从离心管中吸取上清液备用。

1.4 标准溶液的配制与曲线的绘制
用超纯水配制2.0 g/L的GABA标准储备液保存在4℃冰箱内，用超纯水稀释储备液，得到系列浓度标准溶液，按照1.5的方法进行柱前衍生，并用紫外高效液相色谱测定，以峰面积对浓度绘制标准曲线。

1.5 样品与标准溶液柱前衍生反应
称取10 mg OPA，加0.5 mL甲醇溶解后，加入2 mL 0.4 mol/L 硼酸缓冲液(pH 9.40)和30 μL β－巯基乙醇，此衍生剂溶液在12 h内使用效果最佳。

取样品或标准溶液100 μL加入上述溶液100 μL，混匀，反应1 min后进样。

2 结果与分析
2.1 波长的选择
GABA没有紫外或荧光吸收，很难直接检测。

但GABA经衍生反应后会形成具有荧光或紫外吸收的物质，因此采用HPLC法与柱前衍生技术结合可以精确测定微量的GABA浓度。

OPA是目前使用最广泛的衍生物质。

在碱性条件下，OPA与GABA反应生成具有较强紫外吸收的衍生化产物［11］。

衍生试剂本身没有紫外吸收，不干扰分离和测定，不须除去过量试剂以及色谱图基线比较平稳等特点，采用OPA衍生物测定GABA，反应迅速和灵敏度高。

GABA与OPA衍生反应方程式［12］(见图 1)。

图1 GABA与OPA衍生反应方程式
取一定浓度的GABA标准样品，在200～400 nm之间进行紫外波长扫描，结果显示最大吸收峰在326 nm处(见图2)，因此选择326 nm做检测波长。

图2 GABA标准品紫外检测图谱
2.2 色谱条件的优化
测定GABA的流动相体系为乙酸钠(pH 6.8)—甲醇—四氢呋喃(A 相，
82∶17∶1;B 相，22∶77∶1，V∕V)，使用梯度洗脱程序测定GABA，通过改变流
动相分配比与洗脱时间对GABA进行分离。

图3为GABA标准溶液在优化色谱条件中分离效果最佳的色谱图，其在柱上的保留时间为13.106 min。

图4为莜麦米酒在此优化色谱条件之下的色谱图，可见，GABA与样品中其他物质达到了基线
分离，不受其他峰的干扰。

其中GABA在柱上的保留时间与标准品一致，为
13.041 min。

同时，空白实验结果表明:衍生剂、流动相及未经衍生的米酒在326 nm处，保留时间为13 min前后均无吸收峰，说明没有来自于其他物质的干扰。

2.3 衍生时间的确定
取0.2 g/L GABA标准溶液7份，分别按照0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 min 进行柱前衍生并进行 HPLC 测定，测得 7 次峰面积为:454.6、482.1、475.7、435.7、412.4、395.4、378.8，结果见图 5。

表明在衍生1 min时峰面积最大，
即衍生时间为1 min时效果最佳。

图5 GABA的衍生稳定性
2.4 线性实验结果
按照1.4 法绘制曲线(见图6)，在0.04～0.5 g/L范围内与GABA峰面积的线性关
系良好，得到的线性回归方程为y=2589x－12.527，R2=0.9985。

图6 GABA的标准曲线
2.5 精密度试验
取0.2 g/L GABA标准溶液6份，测得6次峰面积分别为:505.9、493.3、494.3、507.5、491.8、508.2，计算得RSD为1.6%，精密度较好。

2.6 重复性试验
取同一种莜麦米酒样品溶液5份，测得5次峰面积分别为:690.6、696.7、697.4、689.6、686.9，计算得RSD为0.66%，表明该方法重复性良好。

2.7 回收率试验
取3份莜麦米酒样品溶液，加入一定量的GABA标准溶液，按与莜麦米酒同样的
样品处理方法测定GABA含量，回收率见表2。

平均回收率为99.5%，结果表明
样品处理过程中GABA损失很少。

表2 HPLC法测定GABA的回收率样品号原始质量浓度/(g/L)添加质量浓度/(g/L)最后质量浓度/(g/L)回收率/%平均回收率/%1 0.1837 0.2 0.3818 99.5 2 0.2143 0.2 0.4124 99.5 3 0.2009 0.2 0.3989 99.5 99.5
2.8 最低检出限试验
取GABA标准溶液，加超纯水稀释，然后进行HPLC测定，直到被测标准溶液浓
度所对应的信噪比为3，按公式D1=3NW/A计算最低检出限(D1为最低检出限，N为噪音峰高，W为进样浓度，A为标准品峰高)［12］，双试验求其平均数，最低检出限见表3，结果表明GABA的最低检出限为0.0254 g/L。

表3 GABA最低检出限样品号 N/mA W/g/L A/mAU D1/(g/L) 最低检出限平均
值/(g/L)1 2.4 0.025 7.7 0.0234 2 3.0 0.025 8.2 0.02740.0254
3 结论
OPA柱前衍生，紫外高效液相色谱法检测GABA是近年发展起来的一种新方法。

与测定GABA的其他方法相比，此方法具有灵敏度高、分析过程简捷可靠、试剂
成本较低等特点。

通过精密度、稳定性、重复性、回收率、最低检出限和样品的测定，充分证明了实验的可行性，可用于莜麦及莜麦米酒中GABA含量的测定。

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