生物化学实验

实验一生化实验基本操作
一. 玻璃仪器的洗涤
在生化实验中，玻璃仪器洁净与否，是获得准确结果的重要环节。

洁净的玻璃仪器内壁应十分明亮光洁，无水珠附着在玻壁上。

（一）常用的洗涤方法：
1.一般仪器，如烧杯、试管等可用毛刷蘸肥皂液、合成洗涤剂仔细刷洗。

然后用自来水反复冲洗，最后用少量蒸馏水冲洗2~3次，倒置在器皿架上晾干或置于烘箱烤干备用。

2.容量分析仪器如吸量管、容量瓶、滴定管等，不能用毛刷刷洗。

用后应及时用自来水多次冲洗，细心检查洁净程度，根据挂不挂水珠采取不同处理方法。

（1）如不挂水珠，用蒸馏水冲洗、干燥，方法同上；（2）如挂水珠，则应沥干后用重铬酸钾洗液浸泡4~6小时，然后按上法顺序操作，即先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗，最后干燥。

3.粘附有血浆的刻度吸量管等，有三种洗涤方法：（1）先用45%尿素溶液浸泡，使血浆蛋白溶解，然后用自来水冲洗；（2）也可用1%氨水浸泡，使血浆溶解，然后再依次用1%稀盐酸溶液、自来水冲洗；（3）以上二法如达不到清洁要求，可浸泡于重铬酸钾洗液4~6小时，再用大量自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗2~3次。

4.新购置的玻璃仪器，应先置于1~2%稀盐酸溶液中浸泡2~6小时，除去附着的游离碱，再用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗2~3次。

5.凡用过的玻璃仪器，均应立即洗涤，久置干涸后洗涤十分困难。

如不能及时洗涤，先用流水初步冲洗后浸泡在清水中，待后按常规处理。

（二）使用重铬酸钾洗液（以下简称洗液）时应注意以下几点：
1.需用洗液浸泡的容器，在浸泡前应尽量沥干。

否则会因洗液被稀释而降低洗液的氧化力。

2.Hg2+、Ba2+、Pb2+等离子可与洗液发生化学反应，生成不溶性化合物沉积在容器壁上。

因此，凡接触过上述离子的容器，应先除去上述离子（可用稀硝酸或5~10%EDTA钠清除）。

3.油类、有机溶剂等有机化合物可使洗液还原失效。

因此，容器壁上附有大量油类、有机物时，应先除去。

4.洗液的酸性和氧化性很强，使用时应格外注意，千万不要滴落在皮肤或衣物上，以免灼伤或烧坏。

5.洗液颜色由深棕色变为绿色时，说明洗液已经失效，应停止使用，更换新液。

因重铬酸变成硫酸铬后不再具有氧化性。

备注：重铬酸钾洗液的配制
取重铬酸钾20g溶于20ml蒸馏水中，加热至沸。

冷却后再将200ml浓硫酸慢慢加入，边加边搅拌。

注意：此时可产生高热。

为防止容器破裂，应选用耐酸搪瓷缸或耐高温的玻璃器皿，切忌用量筒及试剂瓶等配制。

为防止洗液吸收空气中的水分而被稀释变质，洗液应贮存于带盖的容器中。

当清洁效力降低时，再加入少量重铬酸钾及浓硫酸就可继续使用。

二. 吸量管的使用
吸量管和定量吸(移)液器(微量加样器)均为用来转移一定体积溶液的量器。

（一）吸量管：生化实验中常用的有三种，最常用的是刻度吸量管。

1.刻度吸量管：
（1）刻度吸量管的种类：
①按容量规格来分，有0.1、0.2、0.25、0.5、1、2、5、10ml等数种。

其精密度按不同的容积可达移取量的0.1~1%。

通常将管身标明的总容量分刻为100等分。

因此，10ml的吸量管一格代表0.1ml；1ml的吸量管一格代表0.01ml,其余类推。

②按“零”点位置来分，有“O”点在吸量管上端的（即读数从上而下逐渐增大），也有“O”点在吸量管下端的（读数从下而上逐渐增大)。

两种标示方法，在使用时各有方便之处。

③按刻度方法来分，刻度吸量管也有两种，一种是刻度刻到尖端的，将液体放出时，应吹出残留在吸量管尖端的少量液体(我实验室的刻度吸量管全部是这一种)，另一种是刻度不刻到尖端的。

（2）刻度吸量管的正确使用方法：用右手拇指和中指夹住管身，将吸量管的尖端伸入试液深处，左手持洗耳球把试液吸入管内至高过刻度以上时，迅速用右手食指按住吸量管的上口，以控制试液的泄放。

吸液后应尽量使吸量管保持垂直，使右眼与刻度等高，稍微轻抬食指或轻轻转动吸量管，使试液面缓慢降落，至管内试液弯月面的最低点与吸量管的刻度线相齐为止。

然后将吸量管插到需加试剂的容器中，让尖端与容器内壁靠紧，松开食指让液体流出。

液体流完后再等15秒钟，捻动一下吸量管后移去（如需吹的吸量管，则吹出尖端的液体后再捻转一下吸量管移去）。

（3）使用刻度吸量管的注意事项：
①选择适当规格的吸量管：吸量管的最大容积应等于或略大于所需容积（ml数）。

②仔细看清吸量管的刻度情况：刻度是否包括吸量管尖端的液体？读数方向是从上而下，还是从下而上？
③拿吸量管时，刻度一定要面向自己，以便读数。

④吸取试剂时应注意三点：一是先吹去吸量管内可能存在的残留液体，二是将吸量管插入试剂液面深部(以免吸液过程中因液面降低而吸入空气产生气泡或管内试剂进入洗耳球)，三是使用洗耳球(不可直接用口吸)。

⑤按吸量管上口时应该用食指，不能用拇指。

⑥吸取粘滞性大的液体(如血液、血浆、血清等)时，除选用合适的吸管(奥氏管)外，应注意拭净管尖附着的液体，尽量减慢放液速度(用食指压力控制)，待液体流尽后吹出管尖残留的最后一滴液体。

⑦使用的吸量管应干净、干燥无水。

如急用而又有水时，可用少量欲取试剂冲洗3次，以免试剂被稀释。

2.移液吸量管：也有两种，常见的一种是吸量管的上端只有一个刻度，另一种是除了在吸量管上端有刻度外，在吸量管下端狭窄处也有一刻度线。

无论哪一种，在使用时将量取的液体放出后，只需将吸量管的尖端触及受器壁约半分钟即可，不得吹出尖端的液体。

3.奥氏吸量管：准确度最高，使用时必需吹出留在尖端的液体。

（二）定量吸(移)液器(微量加样器)：定量吸液器是吸量管的革新产品。

由塑料制成。

目前，因产地厂家不同其质量、价格差异十分悬殊。

1.定量吸液器的优点：使用方便，取、加样迅速，计量准确，不易破损，能吸取多种样品（只换吸嘴即可）。

2.定量吸液器的类型：有两种类型。

（1）固定式：只能取加一定容量的试剂，不能随意调节取加样量。

其规格有10μl、20μl、25μl、30μl、50μl、100μl、200μl、250μl、300μl、400μl、500μl、1000μl等。

（2）可调式：在一定容量范围内可根据需要进行调节取加样量。

例如规格为50～200μl的可调式定量吸液器，可以在50到200μl的范围内根据需要调节成设计容许的各种取加样容量（60μl、85μl、110μl、170μl、200μl等）。

一般来讲，固定式吸液器比较准确，可调式吸液器使用较为方便。

3.定量吸液器的使用方法：
（1）选择适当的吸液器。

吸液前先把吸嘴套在吸引管上，套上后要轻轻旋紧一下，以保证结合严密。

（2）持法：右手四指（除大拇指外）并拢握住吸液器外壳（使外壳突起部分搭在食指近端），大拇指轻轻放在吸液器的按钮上。

（3）取样(吸液)：用大拇指按下按钮到第一停止点，以排出一定容量的空气，随后把吸嘴尖浸入取样液内，徐徐松开大拇指，让按钮慢慢自行复原，取样即告完成。

（4）排液：将吸液器的吸嘴尖置于加样容器壁上，用大拇指慢慢地将按钮按下到第一停止点，停留1秒钟（粘性较高的溶液停留时间应适当延长）。

然后再把按钮按到第二停止点上，让吸嘴沿管壁向上滑动。

当吸嘴尖与容器壁或溶液离开时，方可释放按钮，使其恢复到初始位置。

（5）吸液器用后应及时取下吸嘴。

将吸嘴用自来水冲洗后浸入盛水的容器内（以防干涸），待实验结束后集中仔细清洗。

三. 溶液的混匀
（一）混匀的目的：
⒈使反应体系内的各种物质分子很好地互相接触，充分进行反应；
⒉使欲稀释的溶液成为浓度均一的溶液。

（二）混匀的方法通常有以下几种：
⒈使盛器作离心运动。

⒉左手持试管上端，用右手指轻击试管下半部，使管内溶液作旋转运动。

⒊利用旋涡混合（振荡）器混匀。

⒋不得已时可用干燥清洁的玻璃棒搅匀。

（三）混匀的注意事项：
⒈防止盛器内的液体溅出或被污染。

⒉严禁用手指堵塞管口或瓶口震荡混匀。

四. 离心机的使用
离心法是分离沉淀的一种方法。

它是利用离心机转动产生的离心力，使比重较大的物质沉积在管底，以达到与液体分离的目的。

因液体在沉淀的上部，故称清亮的液体部分为上清液。

电动离心机的使用方法：
1.将欲离心的液体，置于离心管或小试管内。

并检查离心管或小试管的大小是否与离心机的套管相匹配。

2.取出离心机的全部套管，并检查套管底部是否铺有软垫，有无玻璃碎片或漏孔（有玻璃碎片必须取出，漏孔应该用蜡封住）。

检查合格后，将盛有离心液的两个试管分别放入套管中，然后连套管一起分置于粗天平的两侧，通过往离
心管与套管之间滴加水来调节两边的重量使之达到平衡。

3.将已平衡的两只装有离心管的套管，分别放入离心机相互对应的两插孔内。

盖上离心机盖。

打开电源开关。

逐档扭动旋钮，缓慢增加离心机转速，直至所需数值。

达到离心所需时间后，将转速旋钮逐步回零，关闭电源，让离心机自然停止转动后（不可人为制动），取出离心管。

实验二蛋白质的呈色反应—双缩脲反应
一、实验目的
1．了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。

2．了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。

3．学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。

二、实验原理
尿素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。

双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。

蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。

可用于蛋白质的定性或定量测定。

因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。

三、材料、仪器与试剂
尿素；10%氢氧化钠溶液；1%硫酸铜溶液；2%卵清蛋白溶液
四、实验操作
取少量尿素结晶，放在干燥试管中。

用微火加热使尿素熔化。

熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。

冷后，加10%氢氧化钠溶液约1ml，振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。

观察出现的粉红颜色。

要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。

向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml和10%氢氧化钠溶液约2ml，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。

观察紫玫瑰色的出现。

实验三血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
一．实验目的
学习电泳技术的原理和醋酸纤维薄膜电泳的操作方法。

二. 实验原理
带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳。

各种蛋白质都有它特有的等电点，血清中的各种蛋白质亦不例外。

某种蛋白质在其等电
点时，它呈中性状态，该分子既不带正电荷，也不带负电荷，它在电场中既不向阴极移动，也不向阳极移动。

但是在pH比其等电点较高的缓冲液中时，例如:在pH8.6的缓冲液中，由于血清中一些蛋白质的等电点均低于pH7.0，它们都游离成负离子。

在电场中，均会向阳极移动，等电点离pH8.6愈远者，移动速度越快。

各种血清蛋白质因等电点不同，其电离程度或带电数量也就不同，所以，在电场中泳动速度就有差异。

蛋白质分子量小而带电多者，移动速度较快; 分子量大而带电少者，移动较慢。

如此，则血清中所含的各种蛋白质在电场中按其移动快慢可分为清蛋白、α1、α2、β、γ-球蛋白等五条区带。

在电泳过程中，带电颗粒的移动速度除与带电数量和分子量有关外，还受电场强度、溶液的离子强度、介质的粘度等因素影响。

醋酸纤维（二乙酸纤维素）薄膜具有均一的泡膜状结构（厚约120μm），渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用样量少，分离清晰，无吸附作用，应用范围广和快速简便等优点。

目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。

三、实验材料、主要仪器和试剂
1、材料：血清
2、仪器：电泳仪、醋酸纤维素薄膜（2 cm ×8 cm）、点样板、铅笔、尺。

3、试剂：
（1）巴比妥缓冲液（PH=8.6，离子强度0.075）：取巴比妥钠15.458克，巴比妥2.768克溶于少量蒸馏水，稀释至1000毫升。

（2）染色液：氨基黑10B 0.5g、加入甲醇50ml 、冰醋酸10ml、蒸馏水40ml ，混匀。

（3）漂洗液：取乙醇45毫升，冰醋酸5毫升，蒸馏水50毫升混匀。

（4）洗脱液（0.4N 氢氧化钠）：取氢氧化钠16.0克，蒸馏水加至1000毫升。

（5）透明液：95%乙醇（AR）20ml ，冰醋酸（AR）5ml ，混匀。

四. 实验方法及步骤
1. 点样：取醋酸纤维薄膜一条（
2.5×8cm），在薄膜的无光泽面距一端1.5cm 处，预先用铅笔划一条线作为点样线，然后光泽面向下放入缓冲液中浸泡10分钟，待薄膜完全浸透后，取出轻轻夹于滤纸中，吸去多余的缓冲溶液，用点样器的边缘沾上血清后，在点样线上迅速地压一下，使血清通过点样器印吸在薄膜上，点样力求均匀。

待血清渗入薄膜后，以无光泽面向下，加血清的一端朝向电泳槽的阴极，两端紧贴在滤纸（四层）桥上，加盖，平衡2～3分钟，然后通电。

2. 通电：电压120伏，通电45分钟。

3. 染色：通电完毕，关闭电源将薄膜取出，直接浸于染色液中5分钟。

4. 漂洗：将染色后的薄膜取出，依次在第一、第二、第三漂洗液中漂洗，最后用蒸馏水漂洗一遍，使背景完全无色。

5. 脱色：将漂洗干净的薄膜用滤纸吸干，剪下各蛋白区带及一小段未着色的空白区作为空白管，分别置于各试管中，向各管中加0.4N NaOH 4ml，反复振摇使色泽充分浸出。

6. 测定光密度：选用波长为620nm 的单色光，以空白管调零，测定各管光密度。

五、计算
血清蛋白正常值:
实验四淀粉酶的专一性和温度、pH、激活剂
及抑制剂对酶活性的影响
一实验目的
1.通过本实验观察、验证酶的专一性和温度、pH、激动剂及抑制剂对酶活性的影响。

2.熟悉淀粉及其酶解产物的特殊显色方法；电热恒温水浴的使用。

3.了解唾液淀粉酶的收集与预处理。

二实验原理
酶具有高度专一性，一种酶只能催化一种或一类底物发生反应，如淀粉酶只能水解淀粉，不能水解蔗糖。

当淀粉被淀粉酶彻底水解为还原性麦芽糖和葡萄糖时，能使班氏试剂的Cu2+还原成Cu1+，生成砖红色Cu2O沉淀。

淀粉酶的活性受温度、pH、激活剂及抑制剂、酶浓度以及作用时间等多种因素影响，因而水解淀粉生成一系列分子大小不同的糊精。

不同程度的水解糊精可与碘反应生成紫色、棕色或红色络合物。

通过上述特征性反应，并以蔗糖等作对照，便可观察、验证淀粉酶是否具有专一性以及它的催化活性是否受到影响。

三实验主要仪器及试剂
1、仪器：滴管、烧杯、试管（架）及试管夹、恒温水浴箱与水浴锅、脱脂棉、漏斗及纱布、白瓷反应盘
2、试剂：
1％淀粉称取淀粉1g，加少量水调成糊状，加入煮沸的0.3％NaCl溶液至100m1。

1％蔗糖溶液
.班氏试剂A液：取柠檬酸钠173ｇ，无水碳酸钠100ｇ，加水600ml，加热溶解，冷却后稀释至850ml；B液：取结晶硫酸铜（CuSO4•5H2O）17.3ｇ溶于100ml预热的蒸馏水中，冷却后加水至150ml。

将A液缓慢倒入B液中混匀置试
剂瓶备用。

碘液：称取碘4g、碘化钾6g溶于l000ml蒸馏水中，置棕色瓶内贮存备用。

各种pH缓冲液
①pH6.8缓冲液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液772ml，0.1mol/L柠檬酸溶液228ml 混合即成。

②pH4.0缓冲液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液385.5ml，0.1mol/L柠檬酸溶液614.5ml混合即成。

③ pH8.0缓冲液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液972ml，0.1mol/L柠檬酸溶液28ml 混合即成。

6.0.9％NaCl 溶液
.1％CuSO4 溶液
1％Na2SO4溶液
四实验方法及步骤
一、唾液淀粉酶的收集与处理
1.制备唾液
实验者先将痰咳尽，用自来水漱口，以清除口腔内食物残渣，再在口腔内含蒸馏水约15ml，并作咀嚼咕漱运动，3分钟后吐入垫有两层经润湿处理的脱脂纱布的漏斗内，过滤于小烧杯中备用，为与下面稀释唾液相区别，此称制备唾液。

2.煮沸唾液
取上述唾液约2ml，盛入1中号试管中,置沸水浴煮沸5分钟备用。

3.稀释唾液
调整唾液淀粉酶活性，使之在pH6.8、37℃和既无激动剂又无抑制剂条件下，作用5min，水解淀粉至红色糊精为宜。

具体做法是取12凹白瓷反应板一块，按下列步骤操作：
①第1排每凹各加1滴制备唾液，12、13、14凹分别加生理盐水1、2、3滴，用滴管采用抽吸法，由稀到浓（14→12）小心混匀各凹，勿使溅入相邻凹中。

每混匀一凹便取其1滴放入同列的2排凹中，剩余稀释唾液应全部放回原凹中。

②在盛有不同稀释度唾液的第2排各凹中，均加入4滴缓冲液（pH6.8），2滴1%的淀粉液和2滴蒸馏水，用①混匀法充分混匀，置37℃下5min。

③在第2排各凹中加I液一滴，混匀，观察比较各凹颜色，以浅棕-红色对应的稀释倍数，用生理盐水稀释3ml制备唾液备用。

二、唾液淀粉酶的专一性以及温度、pH、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活性影响的观察
（一）取试管3支编号，按下表1操作
表1 唾液淀粉酶专一性的实验观察
试剂试管pH6.8缓冲
液
1％淀粉溶
液
1％蔗糖溶
液
制备唾液煮沸唾液
1 20滴10滴－5滴－
2 20滴10滴－－5滴
3 20滴－10滴5滴－
将上述各管混匀后，置37℃水浴中保温10分钟，然后每管加入班氏试剂20滴，再放入沸水浴中煮沸约15分钟，观察各管颜色反应，并说明原因。

（二）温度影响酶促反应的实验观察
1.取试管3支编号，按下表2操作：
表2 温度影响酶促反应的实验观察
2.将一、二管移入冰水浴中，待各管温度一致后速向各管加入碘液1滴，混匀
后观察各管颜色的区别，并说明温度对酶促反应的影响。

四、pH影响酶促反应的实验观察
1. 取试管3支编号，按下表3操作：
表3 pH影响酶促反应的实验观察
pH4.0缓冲液pH6.8缓冲液pH8.0缓冲液1％淀粉溶液稀释唾液试管1 20滴－－10滴5滴试管2 －20滴－10滴5滴试管3 －－20滴10滴5滴
2.将上述各管混匀后，置37℃水浴中保温10分钟，然后每管加入碘液1滴，混匀后观察各管颜色的区别，并说明pH对酶促反应的影响。

五、激动剂和抑制剂影响酶活性的实验观察
1. 取试管4支编号，按下操作：
表4 激动剂和抑制剂影响酶活性的实验观察
pH 6.8 缓冲液1％淀
粉溶液
蒸馏水0.9％
NaCl
1％
CuSO4
1％
Na2SO4
稀释唾
液
1 20滴10滴10滴－－－5滴
2 20滴10滴－10滴－－5滴
3 20滴 10滴 － － 10滴 － 5滴 4
20滴
10滴
－
－
－
10滴
5滴
2. 将上述各管放入37℃水浴中保温10分钟，然后每管加入碘液1滴，混匀后观各管颜色的区别，并说明激动剂和抑制剂对酶促反应的影响。

注意事项：
1.反应试管应清洗干净，不同酶液、试剂及其滴管不能交叉混用；
2.使用混合唾液，或通过预试选出合适的唾液稀释度，效果更为显著。

实验五 血中葡萄糖含量的测定（邻甲苯胺法）
一. 实验目的
掌握血糖的测定方法。

二. 实验原理
葡萄糖在热的醋酸溶液中，与邻甲苯胺缩合成雪夫氏碱(Schiff base)。

雪夫氏碱呈兰绿色，其最高吸收峰为620nm 波长，颜色深浅与葡萄糖量成正比，和标准液比较求得其量。

反应式如下:
CH NH H (C H O H )
CH OH
24
23
+=C O
CH NH H (C H O H )CH OH
423
C OH
CH N 3
H (C H O H )CH 42C
=OH
H O
2邻甲苯胺
葡萄糖
葡萄糖邻甲苯
雪夫氏碱（绿色）
三、实验材料、主要仪器和试剂
1、材料：血浆
2、仪器：沸水浴、冰浴、分光光度计等。

3、试剂：
（1）邻甲苯胺试剂：取冰醋酸 920毫升，硫脲1.5克，溶解后加入邻甲苯胺80毫升，混匀，再加入饱和硼酸溶液（硼酸6克加水100毫升，放置过夜后过滤备用）42毫升，充分混匀。

置于棕色瓶内密闭保存，至少可用两个月。

（2）葡萄糖标准贮存液(10mg/ml)：准确称取干燥无水葡萄糖1克，加0.25%苯甲酸液至100毫升，置冰箱内保存备用。

（3）葡萄糖标准应用液(1mg/ml)：准确吸取上述贮存液10ml ，加0.25%苯甲酸至100毫升。

（4） 0.25%苯甲酸液：称取苯甲酸2.5克，加入煮沸的蒸馏水1000毫升中，使成饱和液，冷却后，取上清液备用。

（5）蒸馏水。

四. 实验方法及步骤
取试管三支，标号，依下表加入试剂，混匀，置沸水中 15 分钟，立即移入冷水浴中 3-5分钟，选用620nm 的单色光，以空白管调零，读取各管光密度。

五. 计算
葡萄糖mg/dl ＝标准管吸光度测定管吸光度×0.1×1.0100＝标准管吸光度测定管吸光度×100
正常值: 70━100毫克/100毫升（血浆或血清）。

六.附注
1. 本法不需要除去蛋白质，邻甲苯胺试剂只与醛糖显色，血液中其他还原性
物质基本上无影响。

2. 邻甲苯胺试剂与葡萄糖显色的深浅及其稳定性与试剂中邻甲苯胺浓度、冰醋酸浓度、加热时间有关。

此法显色稳定，24小时内无变化。

如将加热时间缩短，生成颜色容易消褪。

3. 此法也适用于全血葡萄糖测定，特别是小儿病人作静脉抽血困难时，可采用指端血或耳垂血 0.1毫升，加入 3% 三氯醋酸溶液1.9 毫升中，以沉淀蛋白质。

离心后吸取上清液 1.0毫升，加入邻甲苯胺试剂 5毫升作为测定管。

在标准管中加入葡萄糖标准应用液（0.05mg/ml ）1.0毫升及邻甲苯胺试剂 5毫升，在空白管中加入蒸馏水 1.0毫升及邻甲苯胺试剂 5毫升，然后按上表进行测定。

测定结果即为全血葡萄糖含量。

4. 轻度溶血的血清对结果无明显影响。

根据推导，血清中含血红蛋白 450毫克/100毫升时，可使测定结果降低约10%。

5. 高脂血的标本最后显色有时会出现浑浊，影响测定结果。

可先制备血滤液后再行测定。

实验六 血清谷丙转氨酶的测定
一. 实验目的
掌握血清谷丙转氨酶的测定方法。

二. 实验原理
血清谷丙转氨酶（S 、G 、P 、T ）作用于丙氨酸及α-酮戊二酸，结果生成谷氨酸与丙酮酸。

丙酮酸与2.4-二硝基苯肼作用，生成二硝基苯腙，此物在碱性溶
液呈红棕色，与经同样处理的标准丙酮酸比色，求得丙酮酸的生成量以表示酶的活性。

丙酮酸二硝基苯腙
红棕色
2,4-二硝基苯肼
C O O H C H 2C H 2C O C O O H C O O H C H 2C H 2C H N H 2C O O H
C H 3
C H N H 2C
O O H
G P T
C H 3C O C O O H
C H 3
C N N H N O 2
N O 2
H 2O
O H
H 2N
H N
N O 2
N O 2
C O O H
三 实验主要仪器及试剂
1、仪器：15×150mm 试管、分光光度计、移液管、新鲜血清等。

2、试剂： （1）M/10磷酸盐缓冲液（PH=7.4）：取磷酸二氢钾 2.69g ，磷酸氢二钾 13.97g 加水溶解后移至100ml 容量瓶中，加蒸馏水至刻度，贮于冰箱中备用。

（2）底物液（基质液）：取DL-丙氨酸 1.79g ，α-酮戌二酸 29.2mg ，先溶于约 50ml 磷酸缓冲液中，然后以1N NaOH 校至 PH=7.4，再以磷酸盐缓冲液稀释到 100ml ，加氯仿数滴防腐，贮存冰箱中一般可用一个月（不生混浊，不生霉即可用）。

（3）丙酮酸标准液（100μg/ml ）：准确称取已干燥至衡重的丙酮酸 12.64 mg ，置于 100 ml 容量瓶中， 以 PH=7.4 的磷酸缓冲液稀释到刻度。

此液必须临用前配制，不能存放。

（4） 2.4-二硝基苯肼液（0.02 %）：称取2.4-二硝基苯肼 20 mg ，溶于10N HCl 10ml 中（或4N HCl 125 ml 中），溶解后再加蒸馏水至 100 ml 。

四. 实验方法及步骤 取15×150mm 中试管 4支，标号，按下表操作:
静止10分钟后，选用 520nm 的单色光，以蒸馏水调零，测定各管光密度。

五. 计算
本法所规定的谷丙转氨酶活性单位的定义是：1ml 血清于37℃与底物作用30分钟，产生2.5μg 丙酮酸为一个谷丙转氨酶活性单位。

血清谷丙转氨酶活性测定管光密度—测定空白管光密度标准管光密度—标准空白管光密度
＝X10X
1
0.1
1
2.5
X
测定管光密度—测定空白管光密度
标准管光密度—标准空白管光密度
＝X40（SGPT活性单位）
正常值：2～40单位/ ml血清。

六. 附注
1. 2.4-二硝基苯肼与丙酮酸的颜色反并不是特异性的，α-酮戌二酸也能与2.4-二硝基苯肼作用而显色。

此外，2.4-二硝基苯肼身也有类似的颜色，因此空白管颜色较深，吸光度常在0.18左右。

2. 可用小白鼠肝匀浆（20倍稀释）代替血清进行实验。

3. 肝匀浆的制备: 用右手抓住小白鼠的尾巴，令其头朝下，然后迅速置桌上，立即用左手按住鼠的颈子，右手猛拉老鼠尾巴，使颈椎卡断死亡。

将肝脏取出，放在滤纸上，用天平称重，放在研钵中，生理盐水5ml研磨，然后再加生理盐水，配成1:19（即20倍稀释）的肝匀浆，用双层纱布过滤，收集滤液备用，此液每ml含G.P.T200单位。