不同耐湿性长豇豆开花结荚期和苗期叶片全蛋白电泳分析

不同耐湿性长豇豆开花结荚期和苗期叶片全蛋白电泳分析胡志辉;杜振海;陈禅友
【摘要】采用改进的低温液氮样品制备技术,运用SDS-PAGE方法对24个不同耐湿性基因型豇豆在开花结荚期和苗期做叶片全蛋白电泳图谱分析.根据两个时期各参试品种的亚基信息分别进行聚类分析,获得了2个系统聚类树.结果表明:在开花结荚期受湿涝害后,24个不同耐湿性的长豇豆品种叶片蛋白质亚基分布存在着明显差异.其聚类成4个品种群,中等耐湿的16个品种在0.40距离处首先聚为一类,对湿涝极敏感的美国地豆独成一簇且在最大距离0.81处才与其余23个品种最终聚为一类.在开花结荚期和苗期两个时期间,长豇豆品种叶片蛋白质亚基分布差异很大,而同一时期内差异较小,12个品种的聚类树明显依两个时期聚为不同的簇,在0.39距离处苗期所有品种聚为一簇,而在0.63距离处开花结荚期所有品种聚为另一簇,两簇在0.75距离时聚为一类.说明长豇豆植株蛋白质表达的时序性差异大于基因型差异,因此不同时期鉴定可能会得出不一致的结论.苗期叶片蛋白质类型丰富,是植物生长发育最活跃而复杂的时期,故选择苗期鉴定具有鉴定方便和信息丰富等优势.
【期刊名称】《种子》
【年(卷),期】2016(035)011
【总页数】6页(P40-45)
【关键词】豇豆基因型;苗期;结荚期;耐湿性;叶片全蛋白;SDS-PAGE
【作者】胡志辉;杜振海;陈禅友
【作者单位】江汉大学生命科学学院, 湖北武汉430056;江汉大学生命科学学院, 湖北武汉430056;江汉大学生命科学学院, 湖北武汉430056
【正文语种】中文
【中图分类】S643.4
total leaf proteins; SDS-PAGE
在世界许多地方，如中国、日本、印度、巴基斯坦、澳大利亚等国家及湿润地区和半干旱地区，湿涝危害严重威胁着农作物的生产，影响高产与稳产，成为广泛关注的严重问题。

迄今，国内外学者已就不结球白菜、芝麻、大豆、黄瓜、玉米等作物湿害的症状、鉴定方法及湿害的机理、耐湿性资源的筛选及耐湿的遗传改良等方面问题做了大量的研究[1-6]。

豇豆(Vigna unguiculata Linn.) 为豆科(Leguminosae)豇豆属(Vigna)植物，可攀缘生长，是耐热耐旱的一年生作物[7]。

我国南方地区夏季降雨量较大，长豇豆生
长季节，常出现远远超过其生理需水量的情况，极易造成湿害，最终导致其产量和品质的下降。

前人从形态学和生理学等角度进行过豇豆品种耐湿特征的描述[8-10]，Sangakkara等[11]研究了土壤水分和钾肥对绿豆和豇豆幼苗生长的影响；Timsina等[12-13]研究了淹水处理下豇豆品种的植株水分关系与生长，以及早熟
性与淹水程度的互作效应。

Ogbonnaya等[14]则通过水培、盆栽和田间试验，证明不同基因型耐旱性有差异，基因型方差占表型总方差的比例高，因而对豇豆耐旱性基因型筛选是可行的。

陈禅友等[15]对60份豇豆品种耐盐性能进行了评判，长
豇豆品种耐湿性的鉴定和筛选尚缺乏研究，对具遗传差异耐湿性的豇豆基因型受胁迫后其遗传表达物——蛋白质的变化等也缺乏研究，影响品种利用工作，有必要
研究不同基因型的耐湿性。

聚丙烯酰胺凝胶电泳方法常用来分析鉴别植物遗传表达物的差异。

豇豆叶片全蛋白在正常或湿涝胁迫后表达产物的变化可能反映出不同豇豆品种的遗传基因功能组差异，暗示着品种耐湿能力的差别。

本研究观测了田间自
然鉴定结果并开展室内苗期实验，对豇豆开花结荚期和苗期叶片全蛋白电泳图谱的亚基分布和位点进行分析，比较不同耐湿性豇豆基因型和不同时期在蛋白质表达上的差异，以揭示豇豆耐湿性遗传多样性，并为耐湿豇豆资源判别和新品种选育提供依据和理论指导。

1.1 植物材料
实验以24个长豇豆品种(见表1)为材料。

1.2 试剂配制
实验试剂尽量选用高标准的国产或进口化学药品，按照常规方法配置。

标准蛋白质(Marker)来自中国科学院上海生物化学研究所。

1.3 取样
1) 开花结荚期田间取样。

调查地点在武汉市什湖农场，该地块排水性较差，土质
为粘壤土(粉质粘土)，地经过翻耕后盖上薄膜。

用地面积为700 m2，共播种56
个品种，每个品种约10 m2。

开长约50 cm，深约15 cm的播种行，根据种子量和试验田的具体情况进行播种。

畦植2行，每隔20 cm播1窝，每窝3～4粒种子。

2015年5月7日播种，6月17日武汉市普降暴雨到大暴雨，试验地平均降
雨量为115 mm，造成严重积水，形成了对长豇豆品种的湿害，此时正值开花结
荚期。

分别于6月29日和7月6日分2次调查各品种30株豇豆的湿害受害情况。

植株的湿涝害的抗性水平分为5级，高抗：无病植株；中抗：0.1%～25%叶片发
病的植株；低抗：25%～50%叶片发病的植株；敏感：50%～75%叶片发病的植株；极敏感：75%以上叶片发病的植株。

从中选用24个不同耐湿性基因型(表1)
作为试验材料。

并在7月6日田间采摘其植株中、上部叶片放入冰壶，快速带回
实验室及时处理取样。

2) 苗期实验室取样。

于2015年7月7日在实验室播种其中12个豇豆品种(表1
中编号为1-12的品种)，取21天苗龄的幼苗第一个三出复叶的叶片制样。

1.4 样品制备
按Masako等[16]和何瑞峰等[17]的方法并加以改进。

取各品种不同时期的新鲜叶片300 mg，重复3次，加鲜样重的15%即45 mg PVP(PVP摄入量为鲜样重的15%时效果最好[18])及少许石英砂于液氮中碾成粉末。

加入3 mL10%(w/v)三氯
乙酸(用丙酮配制，其丙酮中含0.07% β-巯基乙醇)，用磁力搅拌器震荡混匀后悬
浮其中，-20 ℃ 沉淀1 h，于4 ℃，13 000 r/min条件下离心15 min弃上清液。

加入3 mL冷丙酮(其中含0.07% β-巯基乙醇)，用磁力搅拌器震荡混匀后悬浮其中，-20 ℃沉淀2 h或过夜，期间每隔一定时间振荡1次，换液1～2次，以达到充分去色素的目的。

同上离心弃上清液，加入80%冷丙酮(其中含0.07% β-巯基乙醇)，用磁力搅拌器震荡混匀后悬浮其中-20 ℃沉淀1 h。

同上离心弃上清液，取沉淀用真空干燥机真空干燥12 h制成干粉(使样品充分干燥散去丙酮)，-20 ℃保存备用。

1.5 电泳方法
制胶—点样—电泳—胶版固定—染色—脱色—凝胶成像等均参照生物化学技术[19]和豇豆种子蛋白质分析技术方法[20-21]。

1.6 实验数据处理
采用南京大学捷达凝胶成像系统辅助人工读带，以“1”和“0”系统记录谱带，
有带的赋值为1，无带的赋值为0，建立数据库，以DPS软件系统按照Jaccard
相似系数法的UPGMA方法进行品种聚类分析，依24个品种开花结荚期和12个品种2个时期(开花结荚期、苗期)分别建立系统聚类树。

2.1 不同耐湿性基因型长豇豆叶片全蛋白电泳图谱分析
实验选用的24个长豇豆品种具有耐湿代表性，叶片全蛋白提取上采用了改进的低温液氮研磨和丙酮沉降技术，蛋白质图谱经过反复实验具有稳定的重复性。

图谱显带比较清晰，较为全面准确地反映了供试材料的遗传表达物差异。

2.1.1 24个品种开花结荚期叶片全蛋白电泳结果分析
从24个豇豆品种开花结荚期叶片全蛋白质图谱(图1)中共检测出26条亚基带，其中17条多态性带，多态性率为65.38%，9条共有谱带，分别为79.2，64.2，29.6，28.9，25.7，22.1，17.6，16.6，13.8 kD。

总体上，亚基分布范围为97.4～11.3 kD，亚基出现频率变化幅度为0.04～1。

品种平均显带数为17.6条，其中柳翠最多，为23条，美国地豆最少，为11条(图1)。

2.1.2 12个品种苗期和开花结荚期叶片全蛋白电泳结果分析
从12个豇豆品种苗期和开花结荚期的叶片全蛋白质图谱(图2)中共检测出36条蛋白质亚基带，其中16条多态性带，多态性率为44.44%，20条共有谱带，分别为79.2，59.8，52.3，42.4，39.4，33.8，33.0，32.2，30.9，29.6，28.9，27.8，26.5，25.7，22.6，22.1，19.2，18.5，15.5，13.8 kD，总体上，亚基分布范围是107.5～11.3 kD，亚基出现频率变化幅度为0.04～1。

品种平均显带28.9条，亚基数最多的开鲁线豆为34条，最少的美国地豆为21条(表1 )。

比较开花结荚期和苗期电泳图谱差异(图2)，苗期的12个豇豆品种叶片全蛋白质图谱中检测出32条蛋白质亚基带，12条多态性带，多态性率为37.5%，16条共有谱带，其蛋白质亚基相对分子量和出现频率见表2，亚基分布范围是107.5～13.8 kD，亚基出现频率变化幅度为0.04～1。

而同样的12个品种在结荚期的叶片全蛋白质图谱中只检测出26条蛋白质亚基带，反而有14条多态性带，多态性率为53.84%，9条共有谱带，其蛋白质亚基相对分子量和出现频率也列于表2，亚基分布范围是97.4～11.3 kD，亚基出现频率变化幅度为0.04～1。

可见苗期的亚基条带数量明显较开花结荚期多，其品种间的共有性也较开花结荚期大，多态性较小，其分布范围偏于高分子量，而开花结荚期偏于低分子量。

这说明苗期植株蛋白质表达物更丰富，同时可能与开花结荚期受湿害胁迫增加了不同基因型表达物的差异有关。

可见不同时期和方法进行基因型鉴定可能会得出不同的结论，因此在鉴
定长豇豆品种耐湿性时，选择适当的时期和胁迫处理方法十分重要。

2.2 聚类分析
1) 根据24个参试品种开花结荚期叶片全蛋白图谱各亚基的分布情况，运用Jaccard 相似系数法的UPMGA进行聚类分析，建立聚类树(图3)。

可以将供试的24个长豇豆品种分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4个品种群，较耐湿的16个品种在0.40距离处首先聚为一类，对湿涝极敏感的美国地豆独成一簇且在最大距离0.81处才与
其余23个品种最终聚为一类。

2) 根据12个参试品种开花结荚期和苗期的叶片全蛋白的各亚基分布情况，运用Jaccard相似系数的类平均数(UPMGA)方法进行聚类分析，建立聚类树(图4)。

将供试的12个豇豆品种依两个时期分为不同簇，在0.39距离时苗期所有品种聚为
一簇(S簇)，而在0.63距离时开花结荚期所有品种聚为另一簇(F簇)，两簇在0.75距离时聚为一类。

充分体现出长豇豆植株蛋白质表达的时序性差异大于基因型差异，同样说明鉴定豇豆品种耐湿性时，时期的确立很重要。

从图3、图4可以看出，苗期矮虎和美国地豆等在0.24距离时被聚为一簇(S1)，
而在开花结荚期矮虎与泰国豇豆和五号豇豆等在0.43距离时被聚为一簇(F1)，美
国地豆在0.63距离时独立聚为一簇(F3)。

结合前文提到的田间调查结果，从开花
结荚期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4个品种群来分析，品种群Ⅰ所包含的Ⅰ1和Ⅰ2 2个品种亚群中的品种基本上都是对湿涝有较强抗性的品种，品种群Ⅳ由对湿涝害极敏感的美国地豆独立组成。

矮虎和美国地豆苗期被聚为一簇(图4)，可能是因为二者都有
矮生习性(表1)等共性；在开花结荚期分散在不同品种群(图3)，特别是美国地豆
单独成为一簇，这可能是其对湿涝害极敏感的表现，其蛋白质亚基分布与其它所有品种相比缺少41.6 kD的蛋白质亚基。

但抗性相同的品种也不一定全聚在一起，因为聚类原理是根据亚基分布相似性来聚类的，所以不同抗性的品种可能有很多共有的亚基，而特异的亚基所占比例偏少。

如矮虎所在的Ⅰ1品种亚群主要是对湿涝害有中等抗性的品种，但其所在的簇中泰国豇豆是高抗品种。

而2个高抗品种鄂豇豆二号、香港粉豆和3个极敏感品种开
鲁线豆、长白豇豆、象牙白在0.42和0.50距离时分聚在品种群II和品种群III中，其中鄂豇豆二号和开鲁线豆、长白豇豆在0.42距离时聚在品种群Ⅱ中，香港粉豆
和象牙白在0.50距离时聚在品种群Ⅲ中。

就蛋白质亚基分布情况来看，品种群Ⅱ
中3品种共有13个蛋白质亚基，所以根据聚类原理，它们聚在一起了，但鄂豇豆二号具有的46.1 kD蛋白质亚基，两极敏感品种没有。

品种群Ⅲ中香港粉豆，象
牙白共有13个蛋白质亚基，但香港粉豆具有的32.2 kD和22.6 kD亚基，象牙白没有。

在开花结荚期，耐湿品种鄂豇豆二号、香港粉豆和泰国豇豆，它们之间共有13个蛋白质亚基，鄂豇豆二号特有46.1 kD亚基，香港粉豆特有79.2 kD亚基，泰国豇豆特有33.0 kD亚基。

极敏感品种美国地豆、开鲁线豆、长白豇豆和象牙白，它们之间共有8个蛋白质亚基。

其中，象牙白特有11.3 kD亚基。

由于开花结荚期与苗期发育阶段的差异，以及开花结荚期受到外部不良环境条件刺激，它们叶片表达的蛋白质种类存在明显差异，这与其生理活动需求密切相关，尽管开花结荚期有新的蛋白质条带如42.0，34.5，11.3 kD亚基等，但其蛋白质数
量明显下降，例如，共有带由苗期的20条减少到开花结荚期的9条，品种平均显带带数由苗期的28.9条下降到结荚期17.6条(表1)，因而苗期是植物生长发育最
活跃而复杂的时期。

开花结荚期不同品种叶片全蛋白无论从种类还是数量上都发生了较大的改变，这可能与品种遗传背景和抵抗外界环境中湿涝害胁迫都有关系。

除去所有品种都共有的9个蛋白质亚基，高抗品种与极敏感品种的差异主要体现在79.2，46.1，41.6，33.0，22.1 kD和11.3 kD 6个蛋白质亚基的有无上，推测其可能与长豇豆耐湿涝害有关。

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