SYBR Green实时定量PCR检测急性髓系白血病患者BAALC基因表达

SYBR Green实时定量PCR检测急性髓系白血病患者
BAALC基因表达
唐洁;申林;李柏青;赵皓;余晾;郑洪波
【摘要】目的:观察SYBR Green相对定量逆转录聚合酶链反应(RQ-PCR)方法检测急性髓系白血病(AML)患者外周血单个核细胞(PBMC)中脑和急性白血病细胞胞质(BAALC)基因mRNA的表达水平.方法:分离12例初发AML患者和5名健康成年人PBMC,以白血病细胞株K562为阳性对照,提取细胞总RNA并逆转录为cDNA,SYBR Green相对定量RQ-PCR检测BAALC基因表达水平.结果:健康成年人PBMC中检测不到BAALC mRNA的表达,12例AML患者中,有8例BAALC mRNA高表达,与K562比较,其相对值为K562的0.8～5.6倍.结论:用SYBR Green相对定量RQ-PCR可以检测到AML患者PBMC中BAALC基因的表达,该方法稳定、敏感、可靠.
【期刊名称】《蚌埠医学院学报》
【年(卷),期】2010(035)007
【总页数】4页(P656-659)
【关键词】基因表达;白血病;细胞胞质基因;逆转录聚合酶链反应
【作者】唐洁;申林;李柏青;赵皓;余晾;郑洪波
【作者单位】蚌埠医学院,免疫学教研室,感染与免疫安徽省重点实验室,安徽,蚌埠,233030;蚌埠医学院,中心实验室,安徽,蚌埠,233030;蚌埠医学院,免疫学教研室,感染与免疫安徽省重点实验室,安徽,蚌埠,233030;蚌埠医学院第一附属医院,中心实
验室,安徽,蚌埠,233004;蚌埠医学院第一附属医院,中心实验室,安徽,蚌埠,233004;
蚌埠医学院第一附属医院,中心实验室,安徽,蚌埠,233004
【正文语种】中文
【中图分类】Q343.1;R733.71
脑和急性白血病细胞胞质基因(brain and acute leukemia,cytoplasmic,BAALC)
位于染色体 8q22.3,主要表达在造血前体细胞和神经外胚层组织中,而发育成熟的
骨髓和外周血单个核细胞不表达,其所编码的蛋白与任何已知蛋白或功能域均无同
源性。

研究发现[1],BAALC基因在急性髓系白血病(acute myeloid
leukemia,AML)、急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia,ALL)以及
慢性髓细胞性白血病(chronicmyelogenous leukemia,CML)急变期高表达,并且其表达水平与疾病不良预后呈正相关,是AML患者独立的预后不良的分子指标[2-3]。

本研究采用荧光染料 SYBR Green相对定量实时荧光PCR(realtime quantitative reverse transcriptase PCR,RQ-PCR)技术检测 AML患者骨髓细胞BAALC基因表达,评价其可行性。

1 材料与方法
1.1 材料实验所用细胞来源:AML外周血单个核细胞(perpherialblood mononuclear cells,PBMC)来自蚌埠医学院第一附属医院血液科住院患者。

阴性
对照PBMC来自本院健康教职工和学生,阳性对照细胞为K562细胞株(本室保存)。

主要试剂:淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque),比重1.077±0.002(天津灏洋生物制品科技有限责任公司产品);细胞总 RNA提取 Trizol试剂盒(Invitrogen公司产品);RT-PCR试剂盒(Fermentas公司产品);Fast SYBR Green Master Mix试剂盒
和 Stepone plus型荧光定量PCR仪[美国 Applied Biosystems(ABI)公司产品]。

1.2 实验方法
1.2.1 PBMC的分离和 RNA的提取取肝素抗凝的新鲜外周血,常规 Ficoll密度梯度离心法分离获取 PBMC,Trizol提取细胞总 RNA,经紫外分光光度计和 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定浓度和纯度后,-80℃储存备用。

1.2.2 逆转录按Fermentas公司提供 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行操作。

取总RNA 2.0μg,random hexamer primer
1μl,DEPC处理水补充至总体积12μl,65℃反应 5min;冰上冷却,然后加入
5×reaction Buffer 4μl,dNTPmix(10mol/L)2μl,RiboLockTM Ribonuclease Inhibitor(20 u/μl)1 μl,M-MuLV reverse transcriptase(20 u/μl)1μl,使总体积至20μl,25℃5min,然后42℃孵育60min,70℃ 5 min;冰上冷却,-20℃保存。

1.2.3 扩增效率一致性检测将 K562细胞株的cDNA以 5倍倍比稀释 5个浓度梯度,各取2μl进行 SYBRGreen RQ-PCR反应,检测目的基因和管家基因的扩增效率是否一致。

1.2.4 样品 SYBRGreen RQ-PCR反应目的基因BAALC、管家基因β-actin引物根据 DNA序列设计,并经过 NCBI提供的 BLAST程序验证其特异性,均由上海生工生物工程公司合成。

BAALC引物序列:上游为5′-TAGCAGAGA GTCCAA GCA-3′,下游为5′-CAG AAG GTC CCA ACA AAT-3′,产物长度178 bp;β-actin引物序列 :上游为5′-TCC TGT GGC ATC CAC GAA ACT-3′,下游为5′-GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT-3′,产物长度 315 bp。

PCR反应按ABI公司提供的 Fast SYBRGreen Master Mix试剂盒说明书进行。

总体积20μl,Fast SYBR Green Master Mix(2×)10μl,上下游引物(10μmol/l)各0.5μl,cDNA 1μl,加灭菌三蒸水至20μl。

PCR扩增条件:95℃,20 s;95℃,3 s;60℃,30 s;共 40个循环。

1.3 2-△△CT法计算 BAALC基因表达利用公式RQ=2-△△CT计算实验组目的基因相对于对照组的变化倍数来比较基因表达的差异。

△△CT=△CT实验组 -△CT对照
组,△CT=CT目的基因 -CT管家基因,2-△△CT表示实验组目的基因的表达相对于对
照组的变化倍数。

2 结果
2.1 扩增效率一致性分析以 K562细胞株 cDNA稀释倍数的对数值作为横坐
标,△CT作为纵坐标。

β-actin基因所得的直线斜率为 0.970,BAALC基因所得的直
线斜率为 0.926,两者相差绝对值小于0.05(见图 1)。

说明目的基因和内参β-actin 基因的扩增效率基本一致,可以利用 2-△△CT公式进行实验结果分析。

2.2 PCR产物的特异性分析应用 Stepone plus软件生成 BAALC和β-actin基因的融解曲线,BAALC基因 PCR产物的融解曲线峰值在80.09℃左右,βactin基因PCR产物的融解曲线峰值在82.77℃左右,均为单一波峰,并且峰形也较锐利,由此判断扩增产物为特异性(见图 2)。

通过 1%琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物片段的长度
和均一性(见图 3)。

2.3 BAALC mRNA在 AML患者骨髓细胞中的表达健康成年人 PBMC中检测不
到 BAALC mRNA的表达,12例 AML患者中,有 8例 BAALC mRNA高表达,与
K562比较,其相对值为 K562的 0.8～5.6倍。

3 讨论
AML是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病,在临床和生物学行为上存在高度异质性。

目前认为其发病机制是由于克隆中的白血病细胞增殖失控,分化障碍和凋亡受阻而
停滞在细胞分化的早期阶段。

具体的病因和发病机制尚未完全清楚。

对 AML的发病机制、诊断分型、治疗选择和预后判断的实验室检查除形态学分析外,染色体核
型分析以及分子遗传学分析也具有重要意义。

特别是近年来研究发现许多分子标志都与 AML的预后有关。

例如亲病毒整合位点基因(ecotropic viral integration-
1,EVI-1)过表达[4]、ETS相关基因过表达[5]以及核磷蛋白基因(nucleophosmin-1,NPM1)突变[6]等。

其中 BAALC基因在 AML中的高表达与疾病预后的关系更是近年来研究的热点。

2001年 Tanner等[1]首次报道 AML、ALL、CML急变期患者高表达 BAALC,而CML的慢性期和CLL则不表达。

随后的研究发现 BAALC基因高表达的正常核型AML患者整体存活率(overall survival,OS)、无事件生存率(event-free survival,EFS)、长期无病生存率(disease-free survival,DFS)均明显降低,多变量分析显示 BAALC高表达可作为 AML独立的风险因子[7]。

2008年 Langer等[8]通过调查 172例原发正常核型 AML患者的 BAALC基因在缺乏 FLT3-TKD和高ERG表达的情况下与FLT3-ITD、野生型 NPM1、CEBPA基因突变以及MLL-PTD的相关性时发现,BAALC高表达独立预示着完全缓解率低,生存期短,并且与多药耐药基因及干细胞标志物如 CD133、CD34、KIT过表达有关。

因此也认为BAALC基因高表达是一独立的不良预后的指标,并且与特殊的基因表达模式有关。

国内在此方面的研究较少,仅李红艺[9]、钟明华等[10]采用完全定量 RQ-PCR技术检测 BAALC基因表达的两篇报道,结论与上述报道相同。

目前主要采用 RQ-PCR技术检测 BAALC基因表达。

RQ-PCR是一种在 PCR反应体系中加入荧光基团,通过实时检测荧光信号强度的变化来监测PCR扩增反应,并最终对目的基因进行定量检测分析的技术。

RQ-PCR常用的检测模式有 TaqMan探针和 SYRB Green荧光染料两种。

SYBRGreen是一种只与双链 DNA小沟结合的高灵敏 DNA染料,一旦特异性地掺入 DNA双链,便发出强烈荧光信号。

而不掺入链中的 SYBR Green染料分子荧光不变,从而保证荧光信号的增加与 PCR产物的增加完全同步。

因此,在一个体系中,其信号强度代表了双链DNA分子的数量。

这种方法由于不需要使用探针,减少了实验准备和运行投入。

但是由于 SYBR Green可
以与所有的双链 DNA结合,包括非特异性的双链 DNA序列,因此可能会产生假阳
性信号。

实验中我们通过设立熔解曲线分析,如生成单一波峰且峰型较锐利,则说明
产物为特异性。

分析 RQPCR数据最常用的方法是完全定量和相对定量两种[11]。

完全定量检测的是目的转录本的输入拷贝数,通常与标准曲线的PCR荧光信号有关。

相对定量检测的是目的转录本相对于对照转录本的 PCR信号,分析基因表达的相对改变。

本研究的目的是想要获取目的基因 BAALC在不同样品中的表达差异,因此
我们采用的是 2-△△CT法 SYRB Green相对定量 RQ-PCR技术。

利用公式计算目的基因在不同样品中的表达差异。

当荧光信号增强到某一阈值时,CT值被记录下来。

C代表 Cycle,T代表threshold,CT值含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。

每个模板的 CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,CT值越小。

由于不需要使用标准曲线,因此相对定量比绝对
定量法简单易行。

我们的研究结果表明 SYRB Green相对定量 RQ-PCR检测BAALC基因表达特异性强,灵敏度及精确性高,对12例 AML患者的检测结果也初
步证实了本法的可靠性和重复性。

因此我们认为SYRBGreen RQ-PCR可用于AML患者 BAALC基因表达的监测。

[参考文献]
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[8] Langer C,Radmacher MD,Ruppert AS,et al.High BAALC expression associates with other molecular prognostic markers,poor outcome,and a distinct gene expression signature in cytogenetically normal patients younger than 60 years with acute myeloid leukem ia:a Cancer and Leukem ia Group B(CALGB)study[J].Blood,2008,111(11):5371-5379.
[9] 李红艺,魏旭东,吕晓东,等.实时荧光定量 PCR检测 BAALC基因在正常核型急性
髓系白血病中的表达[J].中国现代医学杂志,2008,18(12):1706-1709.
[10] 钟明华,龚明,马亮,等.实时定量逆转录 PCR检测急性髓系白血病患者骨髓细胞BAALC基因表达[J].中日友好医院学报,2009,23(3):153-159.
[11] Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CT
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