黄芩苷对猪链球菌体外抗菌活性试验

饲养饲料Husbandry and Forage2020年第5期
黄苓苷对猪链球菌体外抗菌活性试验
王留刘秀玲梁博
（商丘职业技术学院，河南商丘476100）
摘要：试验采用微量稀释法测定黄苓昔对猪链球菌2型参考菌株的体外最小抑菌浓度，以及黄苓昔对猪链球菌生长曲线和溶血素活性的影响。

结果显示：黄苓昔对猪链球菌2型参考菌株的最小抑菌浓度大于1280滋g-mL-1，抑菌效果较差；黄苓昔在0~64滋g-mL-1的浓度范围内对猪链球菌2型参考菌株的生长无抑制作用；黄苓昔添加浓度为32~64滋g-mL-1时能够显著抑制培养物上清液中猪链球菌溶血素的溶血活性。

关键词：黄苓昔；猪链球菌；体外抗菌；溶血素；溶血活性
中图分类号：S828；S852.61文献标识码：A
黄苓是我国传统中药，是唇形科多年生草本植物黄苓的干燥根，始载于《神农本草经》，其性寒味苦，可除 湿、止血安胎、治疗肺热、咳嗽、湿热、黄痘等，具有抗菌、抗炎、抗变态反应、抗氧化等作用。

黄苓苷是从中药黄苓的干燥根中提取分离得到的一类黄酮类化合物，属葡萄糖醛酸苷类，也是黄苓中药材中含量最多的黄酮类化合物，含量高达12.1%。

药理研究已证明，黄苓苷具有清热镇静、抑菌抗炎、抗氧化等多方面作用［1-2］。

本研究通过体外试验测定黄苓苷对猪溶血性链球菌的最小抑菌浓度、生长曲线和溶血素活性抑制等试验，探讨黄苓苷对猪溶血性链球菌的抗菌作用及机制,为开发用于猪链球菌病治疗的黄苓新兽药制剂提供理论基础。

1材料与方法
1.1试验药物
黄苓苷，购于四川天然药物有限公司，含量85%,为淡黄色结晶粉末。

用二甲基亚砜配置成12.8mg-mL-1的溶液备用。

文章编号：1673-4645(2020)05-0060-03
1.2试验菌株及培养基
猪链球菌2型SS2ATCC43765参考菌株、Todd-Hewitt肉汤培养基仃HB）、无菌脱纤维兔血购于上海索尔生物科技有限公司。

THB培养基按说明书配制，121°C咼压灭菌后备用。

1.3黄苓昔最小抑菌浓度测定
采用微量稀释法冋测定黄苓苷对猪链球菌2型SS2 ATCC43765参考菌株的最小抑菌浓度（MIC）,经2倍倍比稀释后，黄苓苷的终浓度分别为1280、640、320、160、80、40、20、10ug・mL-1。

试验重复3次，取3次试验结果的平均值作为黄苓苷对猪链球菌2型的MIC。

1.4猪链球菌生长曲线测定
参考张伟等同文献报道的方法，猪链球菌2型SS2 ATCC43765参考菌株接种于100mL THB培养基中振荡培养（37C,200rpm）至对数生长前期（。

聞”巾二0.3）,分装于5个50mL锥形瓶中，每瓶15mL。

分别在5个锥形瓶的猪链球菌培养物中加入黄苓苷溶液，使
收稿日期：2020-08-01
作者简介：王留（1978-）,男，副教授，主要从事养猪与猪病防治研究工作，E-mail：yx_wang2005@si 60China Swine Industry
2020年第5期
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培养液中黄苓苷的终浓度分别为0、8、16、32、64 |jg・ml_-1,继续培养至5h,期间每隔0.5h分别测定每瓶猪链球菌培养物的OD600nm光密度值，绘制猪链球菌的生长曲线。

1.5猪链球菌溶血素活性抑制试验
猪链球菌2型SS2ATCC43765参考菌株接种于100mLTHB培养基中振荡培养(37°C,200rpm)至对 数生长前期(OD600nm=0.3),分装于5个50mL锥形瓶中，每瓶15mL。

分别在5个锥形瓶的猪链球菌培养物中加入黄苓苷溶液，使培养液中黄苓苷的终浓度分别为0、8、16、32、64ug-mL"1,继续培养至对数生长后期。

分别将每瓶猪链球菌培养物10000rpm高速冷冻离心1min,分离上清液。

分别在1.5mL离心管加入磷酸盐缓冲液(PBS)875uL、猪链球菌培养物上清液100uL、脱纤维兔红细胞25uL,混匀，37C培养箱内静置0.5h,然后10000rpm高速冷冻离心1min,分离上清液，测定上清液的0D450nm光密度值。

2结果与分析
2.1黄苓苷最小抑菌浓度
试验结果显示，黄苓苷对猪链球菌2型SS2ATCC 43765参考菌株的最小抑菌浓度大于1280ug-mL-1,说明黄苓苷对猪链球菌2型SS2ATCC43765参考菌株抑菌效果较差。

黄苓苷是从中药黄苓中提取的一种黄酮类化合物，具有广泛的药理活性和生物学功能叫陈功义等闻采用细胞模型试验研究了黄苓苷对猪细小病毒感染猪肾细胞的体外作用，结果显示黄苓苷能够显著阻断猪细小病毒感染猪肾细胞，对猪细小病毒引起的细胞病变有一定的抑制作用，阻断和抑制效应与黄苓苷的浓度梯度呈正相关。

闫静等问体外试验结果表明，黄苓苷能够干扰病毒的复制和阻滞病毒的侵入，能有效抑制传染性法氏囊病毒感染鸡胚成纤维细胞。

杨静采用微量稀释法研究了黄苓苷对猪常见致病菌的最小抑菌浓度，结果表明黄苓苷对猪大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有较好的抗菌活性，对链球菌抗菌效果较差，对沙门氏菌和巴氏杆菌无明显的抗菌作用。

魏滋鸿等冋、张伟等冋、刘通等㈣分别研究了黄苓提取物对单增李斯特菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌的抗菌作用，结果提示黄苓提取物对单增李斯特菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌无抑菌作用。

本试验结果显示黄苓苷对猪链球菌2型SS2ATCC 43765参考菌株抑菌效果较差。

2.2黄苓苷对猪链球菌生长曲线的影响
猪链球菌生长曲线见图1,试验显示黄苓苷在0~ 64ug・mL-1的浓度范围内对猪链球菌2型SS2ATCC 43765参考菌株的生长无抑制作用。

魏滋鸿等冋、张伟等冋、刘通等问分别研究了黄苓提取物对单增李斯特菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌生长曲线的影响，结果提示黄苓提取物在0~64u g-mL-1浓度范围内对单增李斯特菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌的生长无抑制作用，本试验结果与其相一致。

2.3黄苓苷抑制猪链球菌溶血素活性
黄苓苷抑制猪链球菌溶血素活性试验结果见表1,结果表明黄苓苷与猪链球菌2型SS2ATCC43765参考菌株共培养后，能够显著抑制培养物上清液中猪链球菌溶血素的溶血活性，黄苓苷添加浓度为32~64ug
*m L-1时，猪链球菌溶血素活性与对照组(0ug-mL-1组)相比差异显著。

溶血素是猪链球菌2型细菌产生的一种外毒素，具有溶血和细胞毒性，是猪链球菌的主要毒力因子，对猪链球菌的感染和免疫都有重要影响，破坏溶血素的溶血活性是降低猪链球菌致病力的主要治疗措施之―。

张伟等玖李根等口、陈庆忠等凹分别研究了黄苓提取物、药桑提取物、银杏叶提取物对猪链球菌溶血素活性的影响，试验结果显示黄苓提取物、药桑提取物、银杏叶提取物均可显著抑制猪链球菌溶血素介导的溶血活
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性，本试验结果与其相一致。

黄苓苷浓度/Pg・mL-108163264
溶血百分比/%86.9180.2477.1854.62a39.67a 注：数据上标a表示与黄苓苷浓度0ug-mL-1组相比差异显著。

参考文献
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(上接第59页)
含有木聚糖酶和植酸酶的日粮中得到证明。

此外，任何—款酶的效果也取决于其底物在日粮中的浓度。

例如，日粮中植酸的含量会影响植酸酶的磷释放潜力，富含高蛋白质原料的使用可能会影响蛋白酶的氨基酸/肽释放。

因此，当评价应用酶搭配组合使用的总潜在营养价值时必须谨慎。

任何进一步扩大饲料酶市场，例如替代碳水化合物酶、脂肪酶等，将有望在已含有两、三种甚至四种现有酶的日粮持续创造价值。

最后，“叠加性”问题并不局限于酶制剂。

事实上，在标准氨基酸消化率系统开发和出版之前，人们并不清楚玉米和豆粕中的氨基酸消化率数值是否是叠加的。

在将来，饲用酶潜在营养价值的标准化系统(考虑到改变日粮营养素消化率或更确切地通过内源性损失校正来确定影响程度)会得到发展。

这类措施很可能会解决酶制剂叠加性的许多问题，同时也为使用者带来更透明的价值计算。

3结论与应用
在全球范围内，碳水化合物酶、植酸酶和蛋白酶的使用每年为动物饲料行业营养投入成本节省逾80亿美元，并对环境的可持续性发展做出了重大贡献，例如减少土壤中氮磷排放。

近年来，营养师对精准饲料配方系统的要求越来越高，因此酶制剂供应商必须针对产品的使用给出明确和透明的推荐以及清楚地阐释潜在营养价值是如何建立和变化的，包括可能导致这种变化的因素等。

这些因素可能针对每一类特定的酶，例如，如果酶的特定底物是有限的，那么该酶的潜在营养价值可能需要进行调整。

最后，应确保在配方中加入酶时，不会出现可能造成价值降低的因素或其他失误。

毋庸置疑，饲用酶在全球获得了巨大成功，然而，随着新技术的开发和现有技术更充分的利用，饲用酶市场也将继续强劲增长。

为保 持这一趋势，饲用酶供应商必须确保产品的推荐方案能满足营养学家和畜牧生产专家对产品透明度和精确度日益增长的需求。

译自：Bedford MR,Cowieson AJ.Matrix values for ex­ogenous enzymes and their application in the real world[J]. The Journal of Applied Poultry Research,2020,29:15-22.
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