高效液相色谱圆二色检测技术在手性化合物分析中的应用

高效液相色谱圆二色检测技术在手性化合物分析中的应用
田　芹　毕承路　任丽萍　汪丽萍　周志强
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(中国农业大学理学院应用化学系,北京100094)摘　要　对近年来高效液相色谱圆二色检测技术在手性化合物分析中的应用进展进行综述,简单介绍了高
效液相色谱圆二色检测器的原理和特点,着重介绍了非手性色谱条件下圆二色检测技术在手性化合物对映
体纯度测定、复杂基质中手性化合物分析以及在手性化合物绝对构型测定中的应用,并讨论了它的应用前景。

关键词　高效液相色谱,圆二色检测器,手性,综述
　2005205216收稿;2005206223接受
1　引 言
手性是自然界的本质属性之一,是大分子和分子水平呈现多种现象的源泉。

在生物化学和药物化学行为中,手性药物异构体之间存在着明显的代谢和药理作用的差别,因此对映异构体的分析对分子立体化学和生物毒性的研究具有重要意义。

多年来国内外学者建立了许多分离纯化手性物质的方法,其中最常见的方法是借助于手性固定相、手性试剂或手性流动相来达到分离分析的目的,这些方法因手性固定相、手性试剂和手性流动相的种类和数量受到很大的限制,并且分析的条件、分析步骤、外来干扰等对实验的结果会产生很大影响,因此产生了可以用普通分析手段检测手性化合物的手性光学方法(Chiraop tical method ),实现该方法的手性检测器有旋光检测器(Polari m etric detect or )、旋光色散检测器(Op tical r otati on dis persi on detect or ORD )和圆二色检测器(Circular dichr ois m detect or CD )[1]。

旋光检测器和旋光色散检测器是利用左、右圆偏振光在被测物介质中折射率不同的基础上建立起来的[2],检测受温度和溶剂的变化影响大,很难做到梯度洗脱,但是对旋光活性化合物而言,是通用型检测器(不需生色团);而圆二色检测器是在对左、右圆偏振光吸收能力不同的基础上建立起来的,克服了旋光检测器和旋光色散检测器的缺点,比它们有更高的灵敏度和选择性
[3],近些年得到了学者的关注。

1980年,
D rake 等[4]首次使用圆二色检测器,在液相色谱上实现了手性化合物的分离及纯度的测定,从此高效液相色谱圆二色检测技术在手性化合物分析上得到不断发展,现已成为手性化合物分析的有力工具
[5,6]。

本文从高效液相色谱圆二色检测技术的原理和特点入手,分析讨论了其应用进展,并展望了其应用前景。

2　圆二色检测的检测原理及特点
当一束平面偏振光通过光学活性物质时,由于左右圆偏振光的折射率不同,偏振面将旋转一定的角度,这种现象称为旋光(Op tical r otati on ),偏振面旋转的角度称为旋光度。

若光学活性物质含有生色团对左、右圆偏振光的吸收能力也不同,则造成通过的左、右圆偏振光不仅速度不同,而且振幅也不一样。

因此,叠加产生的偏振光将不再是平面偏振光,而是椭圆偏振光,这种现象称为圆二色性。

圆二色检测器的响应信号与旋光物质对左、右圆偏振光的吸收差成正比,圆二色性与波长有关,以偏振光的吸光度
差Δ
ε为纵坐标,波长λ为横坐标做图,便得到圆二色谱图。

由于Δε绝对值很小,常用摩尔椭圆度[θ]代替,其中[θ]=3300Δε。

当圆二色检测器与液相色谱联用时,一般来讲,对于单一对映体,在色谱图中
可能出现正峰或负峰;而外消旋体不出峰,如果对映体含量不同,则色谱图上表现出的是占优势百分含量对映体的信号峰(图1)。

圆二色检测器选择性高,只对旋光活性化合物有响应,而无旋光活性的化合物不干扰测定;检测器在温度和溶剂变化时比较稳定,具有梯度兼容性;另外,圆二色检测器与其他检测器的结合使用,能在部第34卷2006年3月 分析化学(FE NX I HUAXUE )　评述与进展Chinese Journal of Analytical Che m istry
第3期427～432
　图1　圆二色原理示意图
Fig .1　Sche matic vie w of high perf or mance liquid chr omat ography 2circular dichr ois m detect or (HP LC 2C D )p rinci p le 分或无手性分离条件下测定对映体的纯度,大大降低了分
离要求;圆二色谱图包含信息量大,结果更直接。

3　高效液相色谱圆二检测技术对映体分析
中的应用
3.1　圆二色检测器在非手性色谱条件下测定对映体纯度
对映体的分离分析常采用手性色谱或毛细管电泳
法[7],但是这些方法都需要手性色谱柱或手性添加剂,而高
效液相色谱圆二色检测器可以在非手性色谱条件下实现对映体纯度的检测。

对于对映异构体,圆二色检测器给出的圆二色信号是两种对映体对左、右圆偏振光的吸收差值(Δε=εL -εR )。

当两种对映体比例趋于相等时,圆二色强度信号减少,直到完全相等时,圆二色谱信号为零,要得到
对映体纯度,需要与紫外2可见光检测器串联使用,同时测出圆二色谱信号(Δ
ε)和紫外吸收信号(ε),其比率称为各向异性因子(g =Δ
ε/ε),仪器可以直接测出g 值。

在一定条件下,各向异性因子与化合物浓度无关,与对映体纯度呈线性[4,8]。

用单一对映体标准品配制成一系列不同纯度的标准溶液,一定条件下等体积准确量进样,测定g 值,用g 值与对映体纯度绘制标准工作曲线,在相同的色谱条件下测定样品的g 值,即可求出对映体纯度。

这种方法的灵敏度高,准确度好,方法可靠,适合作手性化合物,天然产物等的对映体纯度检测[9～11]。

1994年,Bertucci 等[12]首次在非手性色谱条件下用圆二色检测器测定了32甲基环戊酮、葑酮等手性化合物对映体纯度。

在对映体纯度检测中,波长的选择很重要。

对映体纯度的检出限与g 值有关,而手性化合物浓度的检出限与圆二色性和紫外吸收值有关,而g 值最大的波长与圆二色性和紫外吸收最大波长可能不同。

对于对映体纯度处在极值(≤1%或≥99%)和低g 值(2×10-4)的样品[13],只有选择合适的检测波长
才能得到较高的准确度和灵敏度。

为了证实在非手性色谱条件下对映体纯度测定方法的可靠性。

Bossu ′等[14]研究了不理想圆二色信号响应和低g 值(数量级10-4)的右氯敏锭纯度测定,结果表明当圆
二色检测器达到稳定时,可以得到稳定的响应值,方法的建立简单、快速,有很好的线性、灵敏度和准确
度,适合测定不理想圆二色信号响应的对映异构体纯度。

W illia m s 等[1]将圆二色检测器和紫外检测器
用在反相梯度洗脱高效液相色谱上,用非手性C 18柱检测了临床血液样品中抗H I V 药物DPC961(S 体)纯度。

研究表明,10个临床血浆研究中DPC961的平均组分由CD /UV 分析是100.5%,相对标准偏差(RS D )是2.7%,紫外检出限250n m 处是0.2ng,圆二色检出限240n m 处为5ng,在代谢过程中,没有R 对映体检出,该方法与用手性色谱方法得到结果一致。

圆二色检测器在非手性色谱条件下可快速测定对映体过量。

Kudo 等[15]
使用反相高效液相色谱,不经手性分离,通过各向异性因子校正曲线直接测定了东莨菪属植物萃取液中天仙子胺的对映体过量(ee %)。

研究表明,使用圆二色检测器,样品不必经过任何预处理就可以直接测定,得到的对映体过量值与用手性高效液相色谱法分析得到的结果一致。

Slijkhuis 等[16]在非手性色谱条件下使用圆二色检测器,通过圆二色谱与紫外吸收峰面积比(ΔA /A )与对映体过量(ee %)呈线性,测定了右旋安非他明、52羟
基色氨酸、(-)2石杉碱甲和干扰素等化合物的对映体过量。

研究表明,对于复杂基质,圆二色检测器比
紫外检测器选择性高,基质干扰少,可用于药物登记和食品添加剂的对映体过量的测定。

对映体纯度的分析不仅应用在手性化合物的定量方面,而且在对映体合成上也有重要作用。

判断一个不对称合成反应的价值,需要知道产物中一种对映体对另一种对映体的过量程度,能否在有价值的
对映体达到最大量时停止反应是不对称合成的一个关键问题。

M iller 等[17]利用这一方法,根据g 值与
对映体过量(ee%)值在一定的浓度范围内呈线性,测得合成产物的对映体过量。

圆二色检测器的检测限以及化合物在圆二色检测器的线性范围对这种方法都有影响。

实验表明,这种使用非手性色谱圆二
色检测器的方法成功地用在反应过程中监测反应产物的对映体过量。

D ing 等[18]将这种方法应用到寻
824 分析化学第34卷
找不对称合成选择性催化剂的研究中。

Reetz 等[19]在由苯乙酮不对称催化合成苯乙醇的体系中,不需
手性色谱分离,直接快速测定出苯乙醇的对映体过量,高通量筛选此不对称合成的催化剂。

M ika m i
等[20]根据g 值与浓度无关,与对映体过量成正比,利用HP LC 2CD /UV 技术,在非手性条件下快速有效地测定了由二乙锌在联萘酚2锌络合物和希夫碱(Schiff bases )作催化剂的条件下不对称活化合成手性芳醇的对映体过量,为不对称合成中不对称活化策略提供了一种超高通量筛选手性配基与活化剂的组合库的方法。

3.2　复杂基质中手性化合物分析
通常手性药物的分离检测是用手性分离技术先将对映体分离再分别测定,但是由于医药代谢产物,生物代谢产物,天然产物等样品成分比较复杂,基质干扰大,所研究手性化合物成分的量又是微量(痕量)的,常规的手性化合物的分析方法,无法达到理想效果,而高效液相色谱圆二色检测器只对旋光活性物质响应,不受基质干扰,适合复杂基质中手性化合物的分析。

Jenkins 等[21]
使用Chiral pak AD 柱,用含0.1%三氟醋酸的乙醇作流动相,分别用圆二色、紫外、旋光检测器测定了萘普生(nap r oxen )、胃酸抑制剂(nexiu m )、抗血凝剂(Coumadin )等手性药物。

结果表明,紫外检测器是最灵敏的检测器,圆二色检测器的灵敏度虽然不及紫外检测器高,但是由于圆二色检测器仅对手性化合物有响应,所以谱图比紫外检测器简单,干扰少,而旋光检测器的灵敏度太低。

因此,如果样品的成分比较复杂,而我们仅对手性色谱感兴趣,圆二色检测器将是最好的选择。

高效液相色谱圆二色检测器用于临床手性药物代谢研究。

Kanaza wa 等[22]用β2环糊精衍生固定硅
胶凝胶色谱柱,以含1%醋酸的乙腈:0.2mol/L NaCl (13∶78,V /V )为流动相,反相液相色谱圆二色检测器建立了血液中氯羟安定(Lorazepan )分离分析方法。

该方法对于血液中氯羟安定对映体的定量分析,可以达到基线分离,线性良好,符合外消旋药物治疗剂量管理规定,同时圆二色检测器可以测定流出物顺序,跟踪对映体代谢动力学研究,且不受基质干扰。

该方法被用在临床样品中氯羟安定的分析检测,
结果检测出S 对映体,没检出R 对映体。

Kanaza wa 等[23]用圆二色检测器,手性OJ 柱,22丙醇/正己烷
(5∶95,V /V ),含0.1%三氟醋酸作流动相,对血液中氯索药芬(Loxop r ofen )的4种光学异构体进行分离分析。

研究表明,4种对映体达到理想分离,没有杂质干扰。

选择因子分别为:1.14(α1)、1.21(α2)、1120(α3),4种对映体含量分别为24
.75%、25.67%、25.11%和24.47%。

回收率为99.7%～100.4%;最小检出限:0.35μg (UV )、0.85
μg (CD ),成功地检测了健康成人口服60mg 该药片后血浆中4种对映体含量。

高效液相色谱圆二色检测器用在手性药物生物代谢研究中。

Meyring 等[24]使用圆二色检测器测定
了体外生物转化实验中(R )2和(S )2反应停及其代谢产物,并用圆二色仪测定了其绝对构型。

研究表明,对于生物样本保温萃取液中低浓度的代谢物,圆二色检测器可以直接进行手性分析。

从圆二色谱图上得到数据与用量子化学计算得到的数据比较,所有代谢产物绝对构型都得到可靠的确定,明确了反应停药物在大鼠肝微柱中存在的对映体选择性代谢机制。

高效液相色谱圆二色检测器用在天然产物研究中。

Gerhard 等[25]使用高效液相色谱圆二色检测器
结合HP LC 2NMR 和HP LC 2ESI/MS 以及HP LC 2ESI/MS/MS 测定了植物萃取液中异喹啉叶绿素类和奈基异喹啉生物碱类手性化合物的绝对构型。

研究表明,这种方法不需任何分离和净化技术,就可直接对复杂基质中对映体绝对构型进行测定。

3.3　手性化合物绝对构型测定
测定手性化合物的对映体纯度研究、对映体拆分过程的手性识别机理和光活性药物对受体分子的立体选择性作用等,都离不开对各类手性分子的立体构型的测定。

圆二色谱是与化合物的光学活性相关的光谱,其性质与构型之间的对应关系已经建立了经验或半经验规律[26]。

圆二色谱图可以提供许多分子的结构信息,用于手性分子的结构测定,判断分子的绝对构型,获得对映异构体的淋洗顺序等。

高效液相色谱圆二色检测器由于其操作简单,选择性强,包含信息量大,结果更直接等,被广泛用在手性化
合物绝对构型的测定上[27～32]。

Mancini [33]和Massart [34]等同时使用集成电路硅胶色谱柱和OJ 柱,二维非手性/手性液相色谱圆二
924第3期田　芹等:高效液相色谱圆二色检测技术在手性化合物分析中的应用进展
034 分析化学第34卷
色检测器研究了丙烯菊酯8种对映体的分离和流出顺序的测定。

顺反非对映异构体通过硅胶色谱柱分离,然后再经过OJ柱将对映异构体分开,同时利用圆二色检测器在320nm测定了对映异构体的绝对构型,并用单一对映体标样进行了确证。

该方法实现了丙烯菊酯8种对映体的分离和绝对构型的检测,可以用在商业上生产的丙烯菊酯的分离和纯度、绝对构型测定,并且可实现自动化,大批量的测量样品。

克他命(keta m ine)在临床上被用作手术麻醉剂或麻醉诱导剂,外消旋给药,其绝对构型的测定可借助于HP LC2UV2CD得到[35,36]。

克他命对映体经过手性OJ柱被分离,同时用紫外/圆二色检测器检测。

并采用停流技术对克他命进行了紫外/圆二色谱扫描,进行系统分析研究,应用环己酮的八区律[37],从圆二色谱上可得出对映体绝对构型。

B ring mann等[38]应用Chiralcel OD2H柱,高效液相色谱圆二色检测器对异柿萘醇酮(is oshinanol one)对映体进行分离检测,采用停流技术进行紫外/圆二色谱扫描,得出对映体的绝对构型。

在高效液相色谱圆二色检测器对绝对构型的检测上,波长的选择很重要,不同的波长由于能量不同,有可能导致圆二色信号不一样。

Bertucci等[13]用高效液相色谱圆二色检测器研究了外消旋黄烷酮对映体的绝对构型。

结果表明,检测波长的改变导致黄烷酮对映体在圆二色谱图上信号的改变,从圆二色谱图中可以看出第一个流出物在310n m是正峰,而在337nm时则是负峰。

这种类似现象在异柿萘醇酮(is oshinanol one)[38]、柚皮苷(Naringin)[39]对映体以及氯索药芬(Loxop r ofen)[23]其中的一对对映体的圆二色谱中也被观察到。

大多数手性固定相对手性对映体的选择性是不可预知的,跟踪被分离的对映体的流出顺序是重要的,不仅有助于分析手性识别的机理,而且能够对对映体进行水平检测,确定流出顺序的影响。

Zhang[40]等利用高效液相色谱圆二色检测器快速筛选手性柱,确定手性化合物流出顺序和光学活性,该研究同时利用5种不同的固定相(AD、AS、OJ、OD、O I)分离硫康唑(Sulconaz ole)、萨力多胺(Thalido2 m ide)对映体,然后经过圆二色检测器,确定对映体的流出顺序。

多柱HP LC2UV2CD可以很方便的分离和跟踪检测手性化合物对映体,快速高效的筛选手性柱,确定手性化合物光学活性。

4　高效液相色谱圆二色检测技术的应用前景
圆二色检测技术在选择性上具有优势,逐渐引起人们的兴趣,不断的发展起来。

Xu等[41]研究了基于衡量物质对左旋和右旋偏振光顺序吸收光热效应产生的热能差异检测的高效液相色谱2热镜圆二色检测器,并将其应用检测光学活性[Co(en)
]3+I-3络合物,得到左右旋异构体紫外和圆二色色谱图,提
3
供了溶质的光学活性。

研究表明这种检测器有很高的灵敏度,检出限为7.2ng,线性范围2.5×10-5 mol/L～2.5×10-3mol/L。

Rosenz weig等[42]发明了高灵敏度高选择性的双束激光圆二色检测器。

也有在单一波长有很高的灵敏度的圆二色检测器[43],由于只在单一波长上灵敏度高,降低了其适用范围。

这些高效液相色谱圆二色检测器系统常需要停泵才能获取一段波长范围内的圆二色谱图,停流具有很多缺点,不利于实现分析的自动化。

Gert等[44]采用光电二极管阵列或电耦合器件(CCD)实时采集紫外、圆二色光谱,不停流得到ΔA2波长2时间的三维谱图。

同时,还可以得到一定固定波长下的圆二色和紫外色谱图及某一组分流出最大量时的圆二色及紫外光谱图。

用此装置分离检测了(+-)2螺二[2H2苯并吡喃],得到了其圆二色和紫外的三维色谱图。

Ya ma mot o等[45,46]研究了一种多束2圆二色检测器,在圆二色的基础上通过添加一个棱镜或延迟盘到传统的光二极管(P DA)检测器上来实现,并用此检测器在非手性色谱条件下成功的检测了饮料中苹果酸2Cu(Ⅱ)络合物对映体的纯度,此检测器可以用在商业上果汁产品中合成苹果酸对映体测定上。

在商品化的高效液相色谱系统中,该圆二色检测器光学系统与高效液相色谱的其他组成部分相匹配,结构非常紧凑,内部微处理器对圆二色谱进行校正和各向异性因子(g)的测定,同时测紫外吸收与圆二色性,能在非手性色谱条件下直接测定对映体纯度[16]。

该检测器灵敏度高,重现性好,被广泛用在手性化合物的分析上。

高效液相色谱圆二色检测技术经过20多年的发展,已经成为一种实用的手性化合物分析方法,然而由于其灵敏度相对较低,在残留分析上受到限制,同时仪器比较昂贵,其应用还没有引起人们的足够重视,我国目前在此领域的研究还比较少。

由于该方法不需要对样品进行高温气化,一般不必进行衍生
化处理;而且可以不需要手性固定相直接测定对映体纯度,因此,这种方法已被用在不对称合成中高通量的筛选催化剂。

如果工业化学家能将其用于生产实践中快速大量生产感兴趣的光学纯化合物,将产生巨大的社会经济效益。

另外由于手性药物在临床中的广泛应用,高效液相色谱圆二色检测器技术为今后确保用药的安全性将发挥越来越重要的作用。

随着高效液相色谱圆二色检测器技术的进一步发展,它将成为光学纯对映体制备、手性化合物代谢、对映体纯度的测定等研究领域分析的重要检测技术。

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The Appli ca ti on of H i gh Performance L i qu i d Chro ma tography
w ith C i rcul ar D i chro is m D etector i n the Ch i ra l Com pounds
Tian Q in,B i Chenglu,Ren L i p ing,W ang L i p ing,Zhou Zhiqiang3
(D epart m ent of A pplied Che m istry,College of Science,China A gricultural U niversity,B eijing100094)
Abstract　An overvie w on the app licati on of high perf or mance liquid chr omat ography with circular dichr ois m detect or(HP LC2CD)in the chiral compounds is revie wed.The p rinci p le and characteristic of HP LC2CD are si m p ly intr oduced.The app licati on of achiral HP LC2CD t o the enanti omer purity deter m inati on is p resented e mphatically.I n this overvie w als o included the app licati on of HP LC2CD t o the chiral compounds analysis in the comp lex matrix.The app licati on of abs olute configurati on deter m inati on and the devel opment trend is discussed.
Keywords　H igh perf or mance liquid chr omat ography,circular dichr ois m detect or,chirality,review
(Received16May2005;accep ted23June2005)。