鹅细小病毒VP3基因重组腺病毒的构建及其免疫原性

鹅细小病毒VP3基因重组腺病毒的构建及其免疫原性
摘要
小鹅瘟是由鹅细小病毒（GPV）引起的一种急性或亚急性传染病，1~2周龄雏鹅死亡率高达90~100%，严重危害养鹅业的健康发展。

GPV是细小病毒科的重要成员，VP3蛋白是构成病毒衣壳的主要结构蛋白，能诱导机体产生中和抗体。

因此，VP3蛋白成为小鹅瘟基因工程疫苗研制的首选靶蛋白。

本研究通过PCR方法扩增GPV的VP3基因，将其重组至腺病毒载体，在体外包装成能够高效表达VP3蛋白的重组腺病毒，并观察其免疫原性，旨在为研究GPV重组活载体疫苗奠定基础。

（1）VP3基因的重组穿梭质粒的构建：以pDC-VP3重组质粒为模板，采用PCR 方法扩增获得长度为1605 bp的VP3基因，并将其克隆至穿梭质粒pacAd5 CMV K-NpA，获得重组穿梭质粒pacAd-VP3。

（2）VP3重组腺病毒的构建：经Pac I线性化的pacAd-VP3及骨架质粒pacAd5 9.2-100在脂质体介导下共转染HEK293AD细胞，获得重组腺病毒rAd-VP3。

rAd-VP3连续传代至F6代，病毒效价可达10-8.23/0.1 mL TCID50。

（3）rAd-VP3的鉴定：用RT-PCR可从rAd-VP3扩增到长度1605 bp的DNA片段；用Western blot在rAd-VP3感染的HEK293AD细胞培养物检测到分子量大小约57 kD的特异性蛋白条带，该蛋白可与GPV抗血清特异性结合；用rAd-VP3感染的HEK293AD细胞和鹅胚成纤维细胞（GEF）经GPV抗血清和荧光标记的山羊抗小鼠IgG染色后，细胞内均呈现绿色荧光。

上述结果表明，VP3基因能在HEK293AD和GEF中高效表达，重组VP3蛋白能与GPV抗血清发生特异性免疫反应。

（4）rAd-VP3的免疫原性：用rAd-VP3免疫SPF级昆明小鼠血清中抗体效价可达1:264，小鼠血清能有效抑制GPV感染GEF引起的细胞病变；rAd-VP3免疫雏鹅14d后能产生较高水平的GPV抗体，免疫后28 d，血清抗体仍维持在较高水平。

综上所述，本研究成功构建了表达GPV主要结构蛋白VP3的重组腺病毒rAd-VP3。

rAd-VP3能感染HEK293AD和GEF细胞，并在其中高效表达VP3蛋白；rAd-VP3具有良好的免疫原性，可诱导小鼠和雏鹅产生中和抗体。

本研究结果为研究安全、高效的GPV重组疫苗奠定良好的基础。

关键词：鹅细小病毒，VP3蛋白，腺病毒，免疫原性
Construction of Goose Parvovirus VP3 Gene Recombinant Adenovirus and Its Immunogenicity
Abstract
Gosling Plague, seriously harming the healthy development of goose industry, was a kind of acute or sub-acute infection caused by goose parvovirus (GPV), and its mortality rate was up to 90% to 100% in 1-2-week-old goslings. GPV was an important member of the parvovirus genus and VP3 protein was the major structural protein composing virus capsid which could induce neutralizing antibodies. Thus, VP3 became the preferred protein for studying gene engineering vaccine of gosling plague. In this study, VP3 gene, amplified by PCR, was recombined to adenovirus vector, and then recombinant adenovirus efficiently expressing VP3 protein was packed in vitro, finally, immunogenicity was observed. This study was aiming at laying foundation for GPV recombinant live vector vaccine.
(1) Construction of recombinant shuttle plasmid containing VP3 gene: VP3 gene with the length of 1605 bp was amplified by PCR using pDC-VP3 recombinant plasmid as template, and was inserted in the shuttle plasmid pacAd5 CMV K-NpA, obtaining recombinant shuttle plasmid pacAd-VP3.
(2) Construction of recombinant adenovirus containing VP3 gene: pacAd-VP3 and pacAd5 9.2-100 backbone plasmid, linearized by PacI, were co-transfected into HEK293AD cells mediated by liposome, obtaining recombinant adenovirus rAd-VP3.The virus titer could be up to 10-8.23/0.1mL TCID50 when cultured to the 6th generation.
(3) Identification of rAd-VP3: 1605 bp DNA fragment was amplified from rAd-VP3 by RT-PCR; specific protein strips of 57 kD was detected from HEK293AD cells infected by rAd-VP3 with the method of Western blot; HEK293AD and GEF infected by rAd-VP3 appeared green fluorescence after stained with GPV antiserum and labeled goat anti-mouse IgG. Results above showed that recombinant VP3 protein had specific immune response with GPV antiserum.
(4) Immunogenicity of rAd-VP3: serum antibody titers of Kunming mouse(SPF) immuned with rAd-VP3 could reach 1:264, and cytopathetic effect of GEF caused by GPV was restrained by the mouse serum; high levels of the GPV antibodies in goslings were detected after being immuned 14 d, and kept high after 28 d.
In summary, this study successfully constructed recombinant adenovirus rAd-VP3 expressing the major structural protein of VP3. rAd-VP3 could infect HEK293AD and
GEF, in which VP3 protein was highly expressed; rAd-VP3 had good immunogenicity and could induce neutralizing antibodies in mice and goslings. The study laid a good foundation for the study of safe and efficient GPV recombinant vaccine.
Key Words: Goose parvovirus, VP3 protein, adenovirus, immunogenicity
IV
目录
摘要 (I)
Abstract (III)
1 文献综述 (1)
1.1 GPV分类地位、形态特征和理化特性 (1)
1.2 GPV的培养特性 (2)
1.3 GPV分子生物学研究 (2)
1.3.1 基因组结构 (2)
1.3.2 蛋白质 (3)
1.4 小鹅瘟流行病学与症状 (4)
1.5 小鹅瘟的诊断 (5)
1.5.1 临床诊断 (5)
1.5.2 血清学检测 (5)
1.5.3 分子生物学诊断 (6)
1.6 小鹅瘟疫苗的研究进展 (6)
1.6.1 GPV常规疫苗 (6)
1.6.2 GPV基因工程苗 (7)
1.7 腺病毒载体表达系统 (8)
1.7.1 腺病毒载体概述 (8)
1.7.2 腺病毒在动物疫苗研制中的应用 (9)
1.8 本研究目的及意义 (9)
2 鹅细小病毒VP3基因重组腺病毒的构建与鉴定 (12)
2.1 材料 (12)
2.1.1 菌株、毒株、细胞及质粒 (12)
2.1.2 主要试剂 (12)
2.1.3 主要试剂的配制 (13)
2.1.4 主要仪器 (14)
2.2 方法 (15)
2.2.1 GPV VP3基因的扩增 (15)
2.2.2 包含GPV VP3基因的重组穿梭质粒的构建 (15)
2.2.3 腺病毒在HEK293AD细胞中的包装 (18)
2.2.4 重组腺病毒的RT-PCR鉴定 (20)
2.2.5 小鼠抗GPV阳性血清制备 (22)
2.2.6 重组腺病毒的Western blot分析 (23)
2.2.7 重组腺病毒的间接免疫荧光（IFA）分析 (24)
2.3 结果与分析 (24)
2.3.1 GPV VP3基因的扩增 (24)
2.3.2 转化子的PCR筛选 (25)
2.3.3 重组穿梭质粒的酶切鉴定 (26)
2.3.4 质粒共转染HEK293AD细胞的结果 (26)
2.3.5 腺病毒的传代和滴度测定 (27)
2.3.6 重组腺病毒的RT-PCR鉴定 (28)
2.3.7 重组腺病毒Western-blot 鉴定 (28)
2.3.8 重组腺病毒的IFA鉴定 (29)
2.4 讨论 (30)
2.5 小结 (32)
3重组腺病毒rAd-VP3的免疫原性 (33)
3.1 材料与方法 (33)
3.1.1 材料 (33)
3.1.2 ELISA相关试剂的配制 (33)
3.2 方法 (33)
3.2.1 小鼠免疫试验 (33)
3.2.2 雏鹅免疫试验 (35)
3.2.3 结果统计 (35)
3.3 结果 (36)
3.3.1 GPV病毒TCID50的测定结果 (36)
3.3.2 小鼠免疫试验血清特异抗体的检测 (36)
3.3.3 雏鹅免疫试验血清特异抗体水平的检测 (41)
3.4 讨论 (42)
3.5 小结 (44)
4 结论 (45)
致谢 (55)
作者简介 (56)
导师简介 (57)
6
中英文对照缩略词
英文缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒
Amp Ampicillin 氨苄青霉素
AP Ammonium
persulfate 过硫酸胺bp Base
pairs 碱基对BSA Bovine serum albumin 牛血清白蛋白
cDNA Complementary 与RNA互补的DNA CPE Cytopathic
effect 细胞病变DMEM Dulbecco’s minimum essential medium 达尔伯克必需完全培养基DMSO Dimethyl
sulfoxide 二甲基亚砜EB Ethidium
bromide 溴化乙锭EDTA Ethylenediamine
tetraacetic
acid 乙二胺四乙酸二钠ELISA Enzyme linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附试验GPV Goslin-plague
virus 小鹅瘟病毒HRP Horseradish
peroxidase 辣根过氧化物酶HEK293AD Human embryo kidney 293AD cell 人胚肾293AD细胞kD Kilo
Dalton 千道尔顿LB Lauria-Bertani LB培养基
OD Optical
density 光密度值PAGE Polyacrylamide
gel
electropHoresis 聚丙烯酞胺凝胶电泳PBS pHospHate-bufferedsaline 磷酸盐缓冲液
PCR Polymerasechainreaction 聚合酶链反应
rpm Revolutions
per
minute 每分钟的转速
RT-PCR Reverse transcription polymerase chain
reaction
反转录聚合酶链式反应
SDS Sodium dodecyl sulfate 十二烷基磺酸钠Taq Thermus aquaticus DNA polymerase 栖热水生菌DNA聚合酶TBS Tris-buffered
saline Tris缓冲盐溶液TBST Tris Buffered Saline with Tween 洗膜缓冲液TCID50Median tissue culture infective dose 半数细胞感染量TEMED N,N,N',N'-tetramethylethylene
diamine N,N,N',N'-四甲基乙二胺Tris Tri-（hydroxymethy1）-aminomethane三羟氨基甲基甲烷
1 文献综述
小鹅瘟（又称Derzsy病）是由鹅细小病毒（goose parvovirus，GPV）引起的一种急性、亚急性的败血性传染病，主要侵害4周龄内的雏鹅和雏番鸭，以急性肠炎和心，肝，肾实质器官的败血性病变为特征，该病潜伏期短，发病和传播速度快，死亡率高达70~100%[1, 2]。

小鹅瘟的发现是我国兽医界的巨大成就，1956年方定一在扬州首次报道本病，并于1961年分离到了世界上首株本病的病毒，命名为小鹅瘟病毒，由其所导致的疾病命名为小鹅瘟[3]。

国外于1966年由匈牙利学者Derzsy分离到该病毒，但被误认为是流感[4]，直到1971年，Schettler才确定是细小病毒引起了这种疾病[5]，1974年世界家禽协会名其为Derzsy’s病。

小鹅瘟在多个饲养鹅和番鸭的国家均有流行，至2012年我国报道该病的省市已达22个，严重危害着世界养鹅业发展，目前仍无有效的治疗方法，国内外主要依靠疫苗和抗血清来防控该病。

1.1 GPV分类地位、形态特征和理化特性
鹅细小病毒（GPV）归属于细小病毒科依赖病毒属，同属成员还包括番鸭细小病毒(MDPV)[6]，GPV与貂阿留申病毒及来源于犬、猫、牛、猪等的细小病毒同属能够自主复制的单链DNA病毒，但它与上述哺乳动物及绝大多数禽类的细小病毒间不存在抗原相关性或交叉免疫反应[7]，尽管GPV与MDPV在基因组和结构蛋白上具有高同源性（分别为81.9%和89.1%），在病变、致病性、流行性及临床症状上表现出极高的相似度，但研究证明两者的抗原相关性并不高，据此，它们是同一血清型的两个不同的亚型[8]。

2005年有研究发现腺联病毒2（AA V2）能够增加GPV在鹅胚中的增殖[9]，GPV既有细小病毒自主复制的能力又表现出AA V2 Rep蛋白的增殖特性[10]。

GPV被推测是细小病毒属与依赖病毒属杂交的一种病毒，其分类有可能再度变动[11]。

衣壳包围核酸形成了球形或六角形的GPV病毒粒子，无囊膜，直径20~25 nm，二十面体立体对称，电镜察下晶格排列。

完整的病毒粒子和空衣壳（不含核酸）是本病毒的两种存在形式，完整病毒粒子的沉降系数为110S，具有感染性，缺少DNA的病毒衣壳为65S，无感染性，在氯化铯溶液中的悬浮密度分别为1.39~1.42 g/cm3和1.29~1.31 g /cm3，沉降系数为90.5S[12, 13]。

据Schettler 报道，GPV具有较强的抵抗外界理化因素的能力，胰酶、氯仿、0.5%苯酚、1:1000的福尔马林等都不能使其致弱[5]。

方定一的研究资料显示，GPV经50℃处理3 h，37℃下3 d均不减弱它的感染力，经56℃加热1 h的病毒仍可至死鹅胚，但死亡时间比未经处理的延长了96~120 h，65℃热处理30 min也不减弱其毒力，由此可见，GPV具有良好的热稳定性。

尽管GPV对外界具备顽强的防御能力，但并不是坚不可摧，紫外线、福尔马林、氧化剂、β-丙内酯和氨水等可对其灭活[1, 14]。

GPV仅有一个血清型，不能凝集红细胞，但能凝集黄牛
1
精子，且利用抗血清可进行凝集实验[15]。

1.2 GPV的培养特性
GPV主要在鹅胚、番鸭胚及它们的原代细胞中进行培养，在其它禽胚或细胞中不增殖[16]，12~14 d的鹅胚经尿囊腔接种GPV，5~8 d死亡，死亡的鹅胚头颈部、胸部、翅下及腿部出血，增殖的GPV多释放在尿囊液中，因此可通过收集并纯化尿囊液得到一定纯度的GPV病毒，GPV的致病力随着传代次数增多而呈一定规律的变化，在鹅胚上连续传10代后，对鹅胚的致死时间稳定在3~5 d，但对雏鹅的毒力减弱，连续传30代以后几乎对雏鹅丧失了致病力[17]。

GPV能在鹅胚和番鸭胚成纤维细胞中增殖，在鸡胚成纤维细胞（CEF）、PK-15、兔肾上皮细胞等细胞中均不增殖[1, 18, 19]，但有研究显示GPV感染产蛋母鸡后在卵黄提取液中能持续45 d检测到该病毒抗原，由此感染的鸡卵可用于暂时保存GPV，同时可以GPV感染产蛋鸡作为扩增GPV的一种新方法[18]。

GPV主要在细胞核内复制，基因组的合成始于宿主细胞染色体复制开始之后，在细胞培养的同时或者贴壁形成单层细胞之前接种GPV成为了扩增该病毒的最佳时期，成纤维细胞在感染GPV 3~5 d后出现细胞病变（CPE），表现为细胞折光性增强，圆缩、溶解脱落，且CPE随着传代次数增加而愈加明显，伊红-苏木素染色后可见到核内嗜酸性包涵体与合胞体[20, 21]。

1.3 GPV分子生物学研究
1.3.1 基因组结构
GPV是单股线性DNA病毒，能够自主复制，含有数目基本相等的正链和负链DNA的病毒粒子[22]，在病毒核酸提取过程中，由于正负链DNA分子均有末端回文结构，这两种极性链易发生退火形成互补的双链DNA。

GPV基因组(见图1-1)全长为5106 bp，两端为相同的末端反向重复序列（ITR），由回文序列折叠而成，中间为编码区。

ITR长444个核苷酸，ITR的主要功能是作为病毒的复制起点并提供顺式包装信号[23, 24]。

2
图1-1 GPV基因结构示意图[25]
Fig.1-1 The structural schema of GPV
编码区有两个相间18 bp的开放阅读框（ORF），左侧的ORF位于537-2420 bp 之间，共有1884 bp，编码Rep1及另一种小的非结构蛋白[26]，这两种非结构蛋白又称NS1和NS2；右侧的ORF编码结构蛋白，包括VP1、VP2、VP3，其中VP1包含了VP2和VP3全部的氨基酸序列[27]。

GPV中可能存在的3个启动子为P9、P19和P41，分别启动非结构蛋白NS1、NS2和结构蛋白VP1的起始密码子[28, 29]。

1.3.2 蛋白质
GPV的基因组共编码3种结构蛋白和2种非结构蛋白。

结构蛋白包括VP1、VP2和VP3，分别由732、587和534个氨基酸组成，ORF推测分子量大小分别为81.3 kD、65 kD和57 kD，这与已报道的经SDS-PAGE估计的蛋白大小并不一致（分别为87 kD、72 kD和60 kD)[24]。

VP1、VP2和VP3是病毒3种衣壳蛋白，决定GPV的宿主域、病毒嗜性和致病性。

VP1与宿主细胞的特异受体结合，协助病毒或其DNA通过核孔转运至细胞核内，完成病毒粒子对宿主的有效感染[27,30]。

VP1还具有良好的抗原性，马波等[31]运用原核表达制备的VP1，Western blot证实其能特异性结合受GPV感染的鹅阳性血清，Takehara[32]用杆状病毒表达了GPV VP1，并以其为检测抗原，结合免疫荧光方法检测了GPV抗体。

李俚[33]研究制备了针对GPV结构蛋白的单抗，并初步对其相应抗原表位区域进行了鉴定，为VP1疫苗的研究奠定了基础。

据报道，VP2是GPV的主要免疫功能区，具有刺激机体产生中和抗体的作用，即使没有VP1的情况下也能自我组装形成病毒样颗粒，参与免疫反应。

VP2蛋白可在原核表达系统[34]、昆虫表达系统[35]中均能得到很好的表达，且具备良好的抗原性，此外，高旭等[36]利用原核表达获得GPV VP2蛋白制备的亚单位疫苗，能够在BALB/c 小鼠体内产生一定水平的VP2抗体。

GPV衣壳蛋白的4/5均为VP3蛋白，目前有关GPV VP3的研究较多，Zhang等
3
[37]克隆并用原核表达系统表达了GPV VP3基因，以所得VP3蛋白为包被抗原建立了VP3-ELISA方法，成功检测了GPV抗体和MDPV抗体；Ju Huanyu等[38]应用同样方法表达并纯化了VP3蛋白，Western blot证明其具有很好的免疫原性。

Lu Guo等[39]以原核表达并经纯化处理的VP3蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠制备4株单抗，间接ELISA检测4株单抗具有较高的腹水效价，Western blot方法鉴定其与重组GPV VP3蛋白特异结合，IFA试验进一步证明所得VP3单抗可与天然的GPV发生特异性结合；李新华[29]用淋巴细胞杂交瘤技术研制出7株抗GPV单克隆抗体，均同时与GPV 的VP2和VP3多肽链发生反应，说明2种结构蛋白多肽之间可能含有一些相同的抗原决定簇成分。

上述研究表明VP3在常常被选作基因工程的靶基因，表达的VP3蛋白免疫原性较好，这也印证了Zadori等[40]对VP3功能的分析，即VP3包含GPV主要抗原决定簇成分，是主要的免疫保护抗原，因此VP3基因在小鹅瘟免疫防制及诊断中显现出重要的意义。

非结构蛋白包括NS1和NS2，分别由624和459个氨基酸组成，分子量大小分别为68.7 kD和49 kD，NS蛋白产生于病毒复制早期，目前有关其结构功能的研究较少，主要参与病毒的基因复制和表达调控[41-43]。

目前有关GPV非结构蛋白的研究还非常有限，Wang等[44]研究表明，制备的NS1可以用作鉴别水禽是自然感染还是受到重组结构蛋白免疫的检测抗原；仇铮等[45]制备了抗GPV NS1蛋白的单抗，并应用于定位NS1线性抗原表位，为建立基于抗原表位的抗原抗体诊断奠定了基础。

在对细胞的毒性作用上，NS2与NS1蛋白之间表现为协同促进作用，此外，NS2有可能还和病毒的DNA和蛋白合成及病毒增殖有一定的关联，尚绪增等[46]用NS2蛋白建立了GPV检测的间接ELISA方法，有效地检测了感染GPV雏鹅的血清抗体水平。

1.4 小鹅瘟流行病学与症状
小鹅瘟自然情况下仅感染雏鹅、雏番鸭及莫斯科鸭，哺乳动物或其它禽类可抵抗该病的侵袭。

发病率和死亡率与感染禽的年龄密切相关是本病的一个鲜明特点，7~10日龄雏鹅死亡率高达90~100%，10日龄以上死亡率不超过60%，20日龄以上发病率更低，1月龄以上很少发病。

病雏及带毒成年鹅是该病的主要传染源，通过直接或间接接触带毒粪便而造成水平传播，此外该病也可通过鹅胚垂直传播[19]。

小鹅瘟在我国一年四季均有发生，不同地域因气候等的差异造成流行时间的差异，以产蛋和孵化集中的季节多发；本病呈周期性流行，对该病耐过的鹅群会产生对该病的免疫力，下一代雏鹅也从耐过种鹅获得天然被动免疫，本病不会连续在同地区大流行，因此可依据该病的流行特点制定每年更换部分区域免疫种鹅的免疫方案。

野生禽类在迁徙过程中给北欧一些国家带来了该病流行的隐患[47, 48]。

根据病程的长短将小鹅瘟的病理变化分为最急性、急性和亚急性三种类型，它们分别常见于1周龄、1~2周龄和2周龄以上的雏鹅。

本病表观上以消化道炎症及中枢
4
神经系统机能紊乱为特征，潜伏期3~5 d，发病鹅精神萎靡，鼻孔有浆液性分泌物渗出，呼吸困难，昏睡，食欲废绝，拉灰白色或淡黄绿色粪便，临死前可见颈部扭转，抽搐，两腿麻痹等神经症状，有的病雏可能因腹腔积水而呈“企鹅状”姿势站立[49]。

剖检病变集中在消化道，如空回肠的急性卡他性-纤维素坏死性肠炎，回盲肠极度膨大，肠壁菲薄，有状如香肠的肠栓形成。

感染后期可见大腿内侧皮下、胸部肌肉、肺脏、心内外膜等部位出血。

肝脏缩小为正常的1/2~1/3，胆囊膨大2~4倍，充满稀薄的胆汁，胃腺黏膜肿胀并附着较多的黏性分泌物，脾脏表面多见针尖大小的灰白色坏死点，肾脏浑浊肿胀，呈暗红色，质脆[50]，心脏内充满暗红色凝固不良的血液。

这些临床症状和病理变化仅能作为初步诊断，实际中当小鹅瘟与大肠杆菌病、禽流感等混合感染时，病变一般不具有特征性，故需借助实验室诊断方法才能确诊[51, 52]。

1.5 小鹅瘟的诊断
1.5.1 临床诊断
诊断鹅细小病毒病一般首先根据临床症状，病理变化作出初步临床诊断，但由于雏鹅副伤寒，禽霍乱、禽流感、鹅霉菌性脑炎及鹅球虫病等疾病与小鹅瘟的临床症状和病变比较相似，故必须借助实验室方法来确诊。

病毒分离是对小鹅瘟最直接，最经典，最准确的诊断方法之一。

GPV可侵害鹅的肠道、心、肝、脾、肺、肾、胰腺和脑等内脏器官，采集这些病料适当处理后接种12~14 d鹅胚、番鸭胚或它们的原代细胞可增殖病毒。

感染胚一般接种后的5~7 d死亡，胚体表现出头部肿胀，颈部、脚爪，翅下明显出血等示病症状；细胞感染3~5 d出现明显的病变，且经伊红-苏木素染色可观察到Cowdry大型核内包涵体和合胞体[53]。

此外电镜透射观察是检测GPV的一种快速可靠的方法，但GPV个体极小（20~25 nm），外观形态特征也不明显，这给观察带来了困难[54, 55]，另一方面，本诊断方法要求具备专门的设备和人才，不适合在基层推广。

1.5.2 血清学检测
（1）琼脂扩散试验琼扩试验可利用已知阳性血清检测GPV病毒，也可反过来运用GPV抗原检测血清中的抗体。

1987年，郑美玉等[56]进行了浓素GPV与抗血清的琼脂扩散试验，24~36 h观察到了清晰的沉淀线，该方法操作简便、省时、经济、适用于现场快速诊断和大批血清的抗体检测，在基层的流行病调查中具有很高的实用价值，但该方法存在的缺陷是需要多倍浓缩的病毒液和高效价的抗血清，灵敏度不高，特异性不强，最适抗原抗体比例不易确立。

秦爱建等[57]建立了免疫酶琼脂扩散方法，将琼扩实验与酶及底物显色合理结合，灵敏度提高了236倍，弥补了常规琼扩的不足，并发展成为诊断GPV感染和监测免疫鹅体内抗体水平的常用方法。

（2）中和试验病毒与相应的抗体结合，会失去对易感动物的部分甚至全部致病力。

病毒中和实验可用已知的小鹅瘟血清鉴定病毒、也可用已知GPV病原检测免疫
鹅的抗体效价、抗GPV单克隆抗体的效价、康复鹅抗体测定和流行病学调查。

国内外学者建立了用鹅胚及其成纤维细胞检测GPV抗原抗体的病毒中和试验[58-60]，Gong 等[61]采用固定血清，稀释病毒的方法测定了中和抗体滴度，该方法因鹅胚来源常受产蛋季节限制而无法推广应用。

（3）动物保护试验是一种在易感动物上进行的鉴定病毒的方法，一般先用抗小鹅瘟血清注射雏鹅，再用待检病毒攻毒，根据雏鹅受保护的情况初步鉴定病原是否为GPV[19]，另一方面，该方法也用于评估某种小鹅瘟疫苗应用于鹅后能够产生的免疫保护力。

实验室诊断小鹅瘟除了上述常用的方法还包括ELISA、免疫酶斑点法[62]和免疫荧光[63]等。

1.5.3 分子生物学诊断
聚合酶链式反应（PCR）和核酸探针技术是两种常用的诊断GPV的分子生物学方法，它们都具有特异性强，敏感性高的特点。

PCR检测GPV核酸的灵敏度达到0.47 pg，Limn和Sirivan均对应用该技术检测小鹅瘟作了报道[16, 64]，季芳等[65]应用PCR技术鉴别了GPV和MDPV；布日额等[66]根据GPV H1株的VP1与VP3的编码基因设计一对引物，建立了PCR检测方法快速地检测出了感染鹅脏器中的GPV；姚笛等[67]用PCR技术从GPV疫苗株及临床病料中扩增出了与预计目的大小一致（574 bp）基因片段，该方法特异性很强，可用于临床病料快速诊断。

当前有学者研制了针对GPV的PCR检测试剂盒，操作简单，效果稳定，待检病料检出率达96%以上，可用于GPV感染的确诊。

余兵、段玉友等以地高辛标记GPV的一段基因制成了核酸探针，并用该探针建立了斑点杂交法来检测病料GPV的核酸[68, 69]。

布日额[70]用核酸探针技术对4例病鹅进行检测，分别在小肠、肝、心、脾、胰脏等组织中检测到GPV，核酸探针检测鹅细小病毒准确、快速、操作简单、成本低，并从根本上克服了由抗原的多样性和易变性引起的非特异性反应，因此核酸探针技术在实际的病原诊断中具有广泛的应用价值。

1.6 小鹅瘟疫苗的研究进展
1.6.1 GPV常规疫苗
小鹅瘟感染没有特效的治疗药物，主要通过接种疫苗进行免疫预防。

目前常用的小鹅瘟疫苗主要通过鹅胚致弱和鸭胚致弱两种方式得到。

鹅胚弱化苗是以强毒接种鹅胚得到的强毒苗，仅限在小鹅瘟流行地区使用。

方定一是我国研究该病的领军人物，从发现该病，分离病毒到制备强度疫苗都做出了巨大贡献，用所研制的强毒苗免疫开产前的母鹅发现，孵出的雏鹅获得一定量针对小鹅瘟的母源抗体，从而使该病得到一定程度的控制。

1984年周阳生等[71]将方定一从扬州分离的GPV病毒株鹅胚中连续传21代致弱，500倍稀释后以点眼滴鼻方式免疫雏鹅，结果免疫鹅死亡率比对照降低
20.1%，保护率达93.3%，比对照提高6.1%，且免疫鹅攻毒的死亡时间明显推迟。

用鹅胚生产疫苗的缺点是种蛋昂贵，受产蛋季节限制，存在强毒扩散的风险。

鸭胚弱化苗以鸭胚适应强毒株连续传代至毒力变弱而得到的弱毒苗，安全性相对较高。

陈伯伦等[72]采用鸭胚诱变育成一株GPV鸭胚化GD弱毒苗，免疫母鹅后的1~270 d抽检来源于上述免疫母鹅的子代雏鹅，用强毒人工攻击，保护率达到100%。

王春暖[73]用鸭胚连续致弱培养出GPV-98D15株，取得了较好的免疫原性和安全性。

用鸭胚生产小鹅瘟疫苗，种蛋便宜，来源方便，但由于鹅与鸭之间存在着可相互传递的疾病，有可能造成内源性污染和毒力返强。

传统疫苗虽然取得了较可观的免疫保护效果，但在生产环节及安全性等方面仍存在众多的不足，难以满足现代集约化生产模式的需求。

1.6.2 GPV基因工程苗
基因工程疫苗是应用基因工程技术将抗原基因与表达载体连接并转染至动物体内，使抗原基因在动物体内表达并呈递给免疫系统，诱导机体发生体液和细胞免疫，从而达到防病的目的。

核酸疫苗不仅免疫效果好，保护时间长，而且安全性好，价格低廉，因此应用前景广阔。

目前，很多学者已经对GPV VP3蛋白的原核表达与真核表达进行了探索。

赵文婧等[74]将克隆有GPV VP3基因的质粒亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，并在大肠杆菌中诱导表达，Westen-blot检测该蛋白具有良好的反应原性。

王娟[75]将构建的原核表达载体pCold-TF-VP3转化至大肠杆菌也获得了高效诱导表达。

原核表达虽然成本价格低廉，获取目的产物的时间也较短，但由于原核表达系统缺乏目的蛋白侧链的糖基化，在肽链折叠、抗原位点形成以及免疫原性等方面与病毒蛋白均存在一定差异，加上表达系统难以调控，持续表达可能对宿主细胞产生毒害，纯化困难等缺陷，其应用受到了一定限制。

真核表达系统的应用弥补了上述不足，在外源蛋白表达领域备受重视，目前昆虫表达系统、酵母表达系统及哺乳动物细胞系统是最常用的真核表达系统。

丁轲等[76]构建了共表达GPV VP3和鹅白细胞介素-2（IL-2）的分泌型重组乳酸杆菌；Ju等[77]利用杆状表达系统分别在昆虫细胞中表达了GPV的3种结构蛋白VP1、VP2和VP3，并将得到的亚单位疫苗加佐剂免疫4 d雏鹅，结果雏鹅产生了较高的中和抗体滴度，高于灭活苗和活疫苗； Lee等[78]将用杆状病毒真核表达系统在昆虫细胞中表达的GPV-VP2蛋白用0.3%二乙烯亚胺（BEI）灭活后，加上氢氧化铝或 CpGODNs佐剂，免疫9 d的鸭，并于14 d加强免疫一次，结果雏鸭产生了良好的免疫应答；鹿钟文[79]将VP3连接到杆状病毒pFastBac1转移载体中构建重组穿梭质粒，转染Sf9昆虫细胞，间接免疫荧光法证明VP3基因得到了良好的表达。

利用昆虫细胞表达病毒抗原基因为小鹅瘟基因疫苗的研究提供了一个方向。

近年来，病毒用作真核表达载体备受青睐，病毒活载体苗可被视为病毒减毒活疫苗和亚单位蛋白质疫苗的结合，既可以避免亚单位疫苗需要佐剂和多次接种的缺点，又可以诱导全面而持久的免疫反应[80]。

赵丽荣[81]成功地构建了表达GPV VP3基因的。