供者淋巴细胞输注治疗小鼠H22肝癌的实验研究(一)

供者淋巴细胞输注治疗小鼠H22肝癌的实验研究(一)
作者：曾冬香，姜藻，毕延智，张琰
〔摘要〕目的:观察供者淋巴细胞输注（DLI）对小鼠H22肝癌的治疗作用。

方法:荷瘤昆明小鼠分荷瘤对照组（A组）、5.氟脲嘧啶（5.FU）化疗组（B组）、DLI组（C组）及5.FU加DLI组（D组）4组。

比较各组小鼠生存期、抑瘤率及瘤体病理检查结果，检测NK细胞及IL.2的活性。

结果:B、C组生存时间长于A组（P0.01），D组长于C组（P0.01）;B、C、D各组抑瘤率依次为61.3%、34.7%、89.5%;C、D两组NK细胞及IL.2活性明显高于A、B组（P0.05）;病理观察见C、D组大量炎性细胞浸润。

结论:DLI对小鼠H22肝癌有治疗作用，是一种潜在可行的实体瘤细胞过继免疫治疗方法。

〔关键词〕肝癌;供者淋巴细胞输注;移植物抗肿瘤效应;免疫治疗;小鼠随着现代生物技术的发展，生物治疗已逐渐成为治疗肿瘤的重要手段之一。

目前LAK细胞、TIL细胞、TAK细胞等过继性细胞免疫疗法都是给患者回输其自身的淋巴细胞。

本研究通过向荷瘤小鼠体内输注正常的供者淋巴细胞，诱导特有的异体抗肿瘤反应来攻击肿瘤，探索一种新的实体瘤过继免疫治疗方法。

1材料与方法
1.1动物
BALB.C小鼠、KM小鼠，雌性，均为8～10周龄，体重18～22g，由东南大学医学院实验动物中心提供。

1.2试剂
环磷酰胺（cyclophosphamide，CP）为江苏恒瑞医药股份有限公司产品;5.氟脲嘧啶（5.FU）为天津金耀氨基酸有限公司产品。

1.3实体型荷瘤鼠模型建立
无菌操作取传代8d的H22小鼠腹水，台盼蓝染色，活瘤细胞超过90%，调细胞浓度为1×107ml-1，分别取0.2ml接种于KM小鼠右侧腋下皮下，接种后第3天可触及肿瘤结节。

1.4实验分组
共分4组，每组10只（另备3只中途处死）。

A组（荷瘤对照组）:不作任何处理;B组（5.FU化疗组）:接种后第3天开始化疗，5.FU20mg・kg-1腹腔注射，连续用药7d;C组〔供者淋巴细胞输注（donorlymphocytein-fusion，DLI）组〕:接种前11d经脾细胞加CP加供体脾细胞输注的方法〔1〕诱导对BALB.C小鼠的特异性免疫耐受状态，接种后第3、10、17天尾静脉注射供鼠BALB.C脾脏淋巴细胞，细胞数分别为0.5×107、0.5×107及1×107只-1。

D组（5.FU加DLI组）:接种前4d诱导免疫耐受，接种后第3天开始化疗，方案同B组，第10、17、24天予DLI，细胞数同C组。

1.5观察指标
1.5.1生存时间记录接种当天开始至小鼠死亡的时间，计算各治疗组生命延长率。

1.5.2抑瘤率待瘤结节长出后每天用游标卡尺测量瘤体长短径，比较瘤
体生长情况，计算接种后第15天各治疗组抑瘤率。

肿瘤体积=长径×短径 2.2;抑瘤率=（对照组肿瘤体积-治疗组肿瘤体积）.对照组肿瘤体积×100%。

1.5.3瘤体光镜下组织病理学观察接种后第15天各组处死3只小鼠取瘤体，固定包埋切片，HE染色光镜观察。

常规无菌取脾，制备脾细胞悬液以备检测。

1.5.4NK细胞杀伤活性（NKCA）检测参照文献〔2〕的方法略有改动。

取上述已制备的脾细胞悬液4×106ml-1，加入96孔培养板，每孔100μl，每只小鼠脾细胞设3个重复孔。

取传代48h的H22细胞，调细胞浓度为2×105ml-1，每孔加入100μl，使每孔效靶比为20∶1。

平行设效应细胞对照孔。

按MTT方法加人试剂并测OD值，依下式计算杀伤率: NKCA（%）=〔1-（实验孔OD值-效应细胞对照孔OD值）.靶细胞对照孔OD值〕×100%。

1.5.5IL.2的诱生及其活性检测参照文献〔3〕T淋巴母细胞增殖分析法。

（1）IL.2诱生:取上述已制备的脾细胞悬液5×106ml-1放入培养瓶，置37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养40h，离心收集上清液，置-20℃冰箱保存备用。

（2）制备活化的脾淋巴细胞:无菌取正常KM小鼠脾脏，制成5×106ml-1细胞悬液，加入ConA使其终浓度为5mg・L-1，置37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养48h，收集细胞，离心洗涤2次，配成5×105ml-1细胞悬液作为检测IL.2的反应细胞。

（3）IL.2活性检测:将待测小鼠脾细胞上清液用MTT比色法测定IL.2活性。

1.6统计学处理
所有数据采用SPSS统计软件进行分析，结果以ˉx±s或百分率表示，两样本均数比较采用t检验。

2结果
2.1小鼠生存情况
各组小鼠100%死亡。

A组生存时间（16.4±2.5）d;B、C组生存时间分别为（23.3±3.2）、（26.3±3.1）d，较A组明显延长（P0.01）;D组小鼠平均生存期上升到（33.7±5.3）d，生命延长率105.49%，与其他3组相比大大提高（P0.01）。

2.2小鼠肿瘤生长情况
接种后第3天即可扪及瘤结节，A组随即迅速增大，C组增大速度稍慢。

B、D两组用药后3d内肿瘤逐渐缩小，有些甚至完全消失;B组停药后3d左右肿瘤又逐渐增大;D组肿瘤复发时间延长至7d左右，再次DLI 可控制瘤体生长。

接种后15d各组小鼠肿瘤生长情况见表1。

表1接种后15d各组小鼠肿瘤生长情况（略）
1）与A组比较，P0.01;2）与B组比较，P0.01;3）与C组比较，P0.01 2.3对H22肝癌小鼠NK细胞活性的影响。