术中冰冻切片快速免疫组化he染色技术诊断硬化性肺细胞瘤和肺腺癌

术中冰冻切片快速免疫组化ＨＥ染色技术诊断硬化性肺细胞瘤和
肺腺癌的应用对比
沈元龙㊀李㊀琳㊀吴子豪
作者单位:２３００２２㊀合肥㊀安徽医科大学第一附属医院病理科(沈元龙ꎬ李琳)２３００２２㊀合肥㊀安徽医科大学第四附属医院病理科(吴子豪)
通信作者:吴子豪ꎬ４７０９３１２５４＠ｑｑ.ｃｏｍ
㊀㊀[摘㊀要]㊀目的㊀探讨术中冰冻切片快速免疫组化诊断硬化性肺细胞瘤(ＰＳＰ)和肺腺癌的可行性及意义ꎮ方法㊀收集安徽
医科大学第一附属医院２０１８年１月至２０１９年７月ＰＳＰ术中标本１２例设为ＰＳＰ组以及肺腺癌术中标本２６例设为肺腺癌组ꎬ使用术中冰冻切片ＨＥ染色和术中冰冻切片快速免疫组化检测甲状腺转录因子－１(ＴＴＦ－１)㊁雌激素受体(ＥＲ)和细胞增殖核抗原(Ｋｉ－６７)在两种疾病标本中的表达ꎬ以石蜡切片免疫组化结果为金标准ꎬ对比术中冰冻切片快速免疫组化和ＨＥ染色两种方法诊断ＰＳＰ和肺腺癌的正确率ꎮ结果㊀术中冰冻切片快速免疫组化和术中冰冻切片ＨＥ染色诊断ＰＳＰ正确率分别为１００.００％ꎬ５８.３３％ꎬ差异有统计学意义(Ｐ＝０.０３７)ꎮ术中冰冻切片快速免疫组化结果显示ꎬＰＳＰ组ＴＴＦ－１阳性㊁ＥＲ阳性和Ｋｉ－６７阴性表达率分别为１００.００％㊁９１.６７％和８３.３３％ꎬ均高于肺腺癌组ꎬ差异有统计学意义(Ｐ<０.００１)ꎮ结论㊀术中冰冻切片快速免疫组化诊断ＰＳＰ和肺腺癌显著优于术中冰冻切片ＨＥ染色ꎬＴＴＦ－１㊁ＥＲ和Ｋｉ－６７联合可用于术中冰冻切片快速免疫组化指标鉴别诊断ＰＳＰ和肺腺癌ꎮ
[关键词]㊀术中冰冻切片快速免疫组化ꎻ石蜡切片免疫组化ꎻ硬化性肺细胞瘤ꎻ肺腺癌ｄｏｉ:１０ ３９６９/ｊ ｉｓｓｎ １０００－０３９９ ２０１９ １２ ０２６
㊀㊀目前ꎬ术中冰冻切片ＨＥ染色技术是术中快速明确标本病变性质并指导手术方式及范围的重要手段ꎬ
但有些疾病组织细胞形态较为相似ꎬ仅通过ＨＥ染色难以鉴别ꎮ硬化性肺细胞瘤(ｐｕｌｍｏｎａｒｙｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇｐｎｅｕｍｃｏｃｙｔｏｍａꎬＰＳＰ)和肺腺癌冰冻切片ＨＥ染色结果均表现为乳头结构及纤维化㊁硬化背景ꎬ形态学上难以鉴别[１]ꎮ术中冰冻切片快速免疫组化是目前新兴的病理技术之一ꎬ其可在短时间内通过对特殊指标的免疫组化染色进行明确诊断[２]ꎬ可填补术中冰冻切片ＨＥ染色难以确诊的缺陷ꎮ本文以石蜡切片免疫组化确诊
的ＰＳＰ和肺腺癌组织为研究对象ꎬ通过比较术中冰冻切片快速免疫组化及ＨＥ染色检测的甲状腺转录因子－１(ｔｈｙｒｏｉｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ－１ꎬＴＴＦ－１)㊁雌激素受体
(ｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒꎬＥＲ)和细胞增殖核抗原(ｎｕｃｌｅａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎꎬＫｉ－６７)的表达ꎬ探索术中冰冻切片
快速免疫组化用于术中诊断ＰＳＰ和肺腺癌的可行性ꎮ1㊀资料与方法
１.１㊀标本来源㊀收集２０１８年１月至２０１９年７月安徽医科大学第一附属医院经病理确诊的ＰＳＰ患者标本
１２例及肺腺癌标本２６例(原位腺癌８例ꎬ浸润性腺癌１８例)ꎮ所选３８例标本均进行了术中冰冻切片快速免疫组化及ＨＥ染色ꎮ１２例ＰＳＰ患者中ꎬ女性９例ꎬ男性３例ꎬ年龄４２~７１岁ꎬ平均(５３.４２ʃ８.０７)岁ꎮ２６例肺腺癌患者中女性１５例ꎬ男性１１例ꎬ年龄４０~７７岁ꎬ平均(５９.４６ʃ１０.７６)岁ꎮＰＳＰ与肺腺癌的石蜡切[１０]ＬＯＰＥＺＤꎬＦＬＩＣＫＥＲＬꎬＤＯＢＳＯＮＡ.Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆｒａｉｌ
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(２０１９－０３－１２收稿)
(本文编辑:胡欣ꎬ刘菲)
２９３１安㊀徽㊀医㊀学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第４０卷第１２期
ＡｎｈｕｉＭｅｄｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０１９年１２月㊀
片免疫组化病理诊断均依据２０１５版«ＷＨＯ肺肿瘤分类»[３]ꎬ所有入选病例术前均未做放疗及化疗且临床资料完整ꎮ
１.２㊀方法㊀３８例术中标本取部分使用ＬＥＩＣＡＣＭ１９５０冰冻切片机切片４张ꎬ厚７μｍꎻ９５％酒精固定４０ｓꎬ其中１张行冰冻切片ＨＥ染色ꎬ其余行ＴＴＦ－１㊁ＥＲ㊁Ｋｉ－６７冰冻切片免疫组化染色ꎮ另取剩余组织经１０％福尔马林固定ꎬ常规脱水㊁石蜡包埋ꎬ４μｍ连续石蜡切片ꎬ行ＴＴＦ－１㊁ＥＲ㊁Ｋｉ－６７常规石蜡切片免疫组化染色[４]ꎮ以术后石蜡切片免疫组化结果为金标准ꎬ比较术中冰冻切片快速免疫组化和ＨＥ染色鉴别诊断ＰＳＰ和肺腺癌的正确率ꎮ
１.２.１㊀主要试剂㊀单克隆抗体即用型ＴＴＦ－１(克隆号ＭＸ０１１ꎬ１ʒ１００稀释)㊁ＥＲ(克隆号ＳＰ１ꎬ１ʒ１００稀释)和Ｋｉ－６７(克隆号ＭＸ００６ꎬ１ʒ１００稀释)㊁ＭａｘＶｉｓｉｏｎ试剂盒(含有通用型二抗ꎬ１ʒ２００稀释)及３ꎬ３－二氨基联苯胺(３ꎬ３－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅꎬＤＡＢ)显色试剂盒均购自福州迈新试剂有限公司ꎮ
１.２.２㊀术中冰冻切片快速免疫组化染色方法㊀术中冰冻切片快速免疫组化法[２]:固定后的切片去离子水冲洗３０ｓꎬ置于３％的双氧水中浸泡３ｍｉｎꎻ磷酸盐缓冲液(ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓａｌｉｎｅꎬＰＢＳ)冲洗３次ꎬ每次３０ｓꎻ切片分别滴加ＴＴＦ－１㊁ＥＲ和Ｋｉ－６７抗体后置于湿盒内３７ħ孵育７ｍｉｎꎻＰＢＳ冲洗３次ꎬ每次３０ｓꎻ滴加二抗湿盒内３７ħ孵育５ｍｉｎꎻＰＢＳ冲洗３次ꎬ每次３０ｓꎻＤＡＢ室温显色３ｍｉｎꎻ自来水冲洗３０ｓꎻ复染苏木素３０ｓꎻ温水返蓝３０ｓꎻ经梯度酒精脱水㊁二甲苯透明后中性树胶封片ꎮ
１.３㊀观察指标与判断标准㊀观察术中冰冻ＨＥ切片和免疫组化切片染色的ＴＴＦ－１㊁ＥＲ㊁Ｋｉ－６７的表达ꎮＴＴＦ－１表达定位于细胞核ꎬ阳性染色呈棕黄色ꎬ阳性细胞率大于１０％为阳性表达[５]ꎻＥＲ表达定位于细胞核ꎬ阳性染色呈黄色或棕黄色ꎬ阳性细胞率大于１％为阳性表达ꎻＫｉ－６７定位于细胞核ꎬ阳性细胞率小于等于１０％为阴性表达[６]ꎮ上述结果的判读采用双盲法ꎬ由病理科两位高年资主治医师独立对术中冰冻ＨＥ切片和免疫组化切片以及术后常规免疫组化切片进行判读ꎬ结果不一致时请第３位高年资主任病理医师判断ꎮ对于术中冰冻切片快速免疫组化结果ꎬ当ＴＴＦ－１阳性㊁ＥＲ阳性和Ｋｉ－６７阴性三项条件均符合时ꎬ则诊断为ＰＳＰꎬ当ＴＴＦ－１阴性㊁ＥＲ阴性和Ｋｉ－６７阳性三项条件均符合时ꎬ则诊断为肺腺癌ꎮ对于术中冰冻切片ＨＥ染色结果ꎬ则根据镜下组织学图像进行诊断ꎬ诊断正确率＝术中冰冻切片快速免疫组化确诊病例数/石蜡切片免疫组化确诊病例数ˑ１００％ꎮ
１.４㊀统计学方法㊀采用ＳＰＳＳ１６.０软件进行统计处理ꎬ计数资料用百分比表示ꎬ采用Ｆｉｓｈｅｒ确切概率法检验ꎬ以Ｐ<０.０５为差异有统计学意义ꎮ
2㊀结果
２.１㊀术中冰冻切片免疫组化与石蜡切片免疫组化染色结果比较㊀对比ＴＴＦ－１㊁ＥＲ和Ｋｉ－６７的染色结果ꎬ术中冰冻切片快速免疫组化和石蜡切片免疫组化染色结果一致(图１㊁２)ꎮＰＳＰ组中ꎬＴＴＦ－１不仅表达于表面细胞ꎬ同时表达于间质中的圆形细胞ꎬ而在肺腺癌组中ꎬＴＴＦ－１仅在表面上皮细胞中表达ꎬＴＴＦ－１在ＰＳＰ组表面细胞和圆形细胞中表达均有不同程度增高ꎬ着色深ꎬ排列紊乱ꎬ部分呈团块状(图１ａ㊁２ａ)ꎻＥＲ在ＰＳＰ组中表达于表面细胞和间质中的圆形细胞ꎬ而在肺腺癌组中不表达(图１ｃ㊁２ｃ)ꎻＫｉ－６７在ＰＳＰ组中表达较低ꎬ一般不超过５％ꎬ而肺腺癌组中Ｋｉ－６７表达显著升高(图
１ｅ㊁２ｅ)ꎮ
图１㊀ＰＳＰ术中冰冻切片快速免疫组化与
术后石蜡切片免疫组化结果对比
注:ａ㊁ｃ㊁ｅ为术中冰冻切片快速免疫组化ＴＴＦ－１㊁ＥＲ和Ｋｉ－６７的表达ꎻｂ㊁ｄ㊁ｆ为术后石蜡切片免疫组化ＴＴＦ－１㊁ＥＲ和Ｋｉ－６７的表达(ʏ指向围成管腔结构的表面上皮细胞ꎬһ指向管腔之间的间质圆形细胞ꎬ比例尺１００μｍ)
３９３１
第４０卷第１２期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安㊀徽㊀医㊀学㊀２０１９年１２月㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀ＡｎｈｕｉＭｅｄｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ
图２肺腺癌术中冰冻切片快速免疫组化
与石蜡切片免疫组化结果对比
注:ａ㊁ｃ㊁ｅ为术中冰冻切片快速免疫组化ＴＴＦ－１㊁ＥＲ和Ｋｉ－６７的表达ꎻｂ㊁ｄ㊁ｆ为术后石蜡切片免疫组化ＴＴＦ－１㊁ＥＲ和Ｋｉ－６７的表达(ʏ指向围成管腔样结构的表面上皮细胞ꎬһ指
向管腔之间的间质细胞ꎬ比例尺１００μｍ)
２.２㊀术中冰冻切片快速免疫组化和ＨＥ染色诊断结果比较㊀以术后石蜡切片免疫组化病理诊断结果为复核ꎬ对于１２例ＰＳＰ的术中诊断显示ꎬ术中冰冻切片ＨＥ染色仅正确诊断７例(５８.３３％)ꎬ而术中冰冻切片快速免疫组化正确诊断１２例(１００％)ꎬ冰冻切片快速免疫组化染色诊断正确率优于ＨＥ染色ꎬ差异有统计学意义(Ｐ＝０.０３７)ꎻ对于肺腺癌的术中诊断ꎬ术中冰冻切片ＨＥ染色诊断２０例(７６.９２％)ꎬ术中冰冻切片快速免疫组化诊断２５例(９６.１５％)ꎬ差异无统计学意义(Ｐ＝０.０９９)ꎮ见表１ꎮ
表１㊀术中冰冻切片快速免疫组化法和ＨＥ染色诊断
㊀㊀㊀㊀㊀ＰＳＰ与肺腺癌的正确率比较
组别例数术中冰冻切片
ＨＥ染色
术中冰冻切片
快速免疫组化
确诊正确率(％)确诊正确率(％)
Ｐ值
ＰＳＰ组１２７５８.３３１２１００.０００.０３７∗肺腺癌组２６２０７６.９２２５９６.１５０.０９９∗㊀㊀注:∗为Ｆｉｓｈｅｒ确切概率法
２.３㊀ＴＴＦ－１㊁ＥＲ和Ｋｉ－６７在ＰＳＰ和肺腺癌中的表达比较㊀ＴＴＦ－１阳性㊁ＥＲ阳性及Ｋｉ－６７阴性表达率在ＰＳＰ组织中显著高于肺腺癌组织ꎬ差异有统计学意义(Ｐ<０.０５)ꎮ见表２ꎮ表２㊀ＴＴＦ－１㊁ＥＲ和Ｋｉ－６７在ＰＳＰ和肺腺癌中的表达比较[例(％)]指标ＰＳＰ(ｎ＝１２)肺腺癌(ｎ＝２６)Ｐ值ＴＴＦ－１阳性１２(１００)１(３.８５)０.０００∗ＥＲ阳性１１(９１.６７)２(７.６９)０.０００∗Ｋｉ－６７阴性１０(８３.３３)２(７.６９)０.０００∗㊀㊀注:∗为Ｆｉｓｈｅｒ确切概率法
3㊀讨论
术中冰冻切片ＨＥ染色已广泛应用于临床手术中快速诊断ꎬ然而ꎬ对于部分细胞形态相似的病种组织ꎬ该方法易漏诊㊁误诊ꎬ甚至造成患者二次手术或医疗事故ꎮ石蜡切片免疫组化染色是病理工作中重要的检测手段之一[７]ꎬ但其染色时间长ꎬ无法在术中及时提供诊断结果ꎮ术中冰冻切片结合快速免疫组化染色可大幅提高术中冰冻切片的病理诊断正确性和效率[８]ꎮ
ＰＳＰ的形态学特点是肿瘤内可同时存在由两种细胞类型构成的乳头状㊁实性㊁硬化性和血管瘤样病变区域ꎬ同时可见肥大细胞浸润㊁泡沫细胞和含铁血黄素细胞聚集等现象ꎮ故冰冻切片ＨＥ染色很难将ＰＳＰ与同样有乳头结构及纤维化㊁硬化背景的肺腺癌相鉴别[９－１０]ꎮ因此ꎬ本文探索术中冰冻切片快速免疫组化染色对于ＰＳＰ和肺腺癌鉴别诊断价值ꎬ具有切实的临床意义ꎮ已有研究[１１]证实ꎬ术中冰冻切片快速病理诊断是决定手术方式的关键ꎬ可以避免术后过度治疗ꎮＴＴＦ－１是核转录蛋白ＮＫｘ２家族中的一员ꎬ是肺㊁甲状腺和间脑早期发育过程中的一种组织特异性转录因子ꎮＤｅｖｏｕａｓｓ等[１３]发现ＴＴＦ－１高表达于ＰＳＰ的表面细胞和圆形细胞ꎬ而仅表达于肺腺癌的表面细胞ꎮ本研究同样发现ＴＴＦ－１在两种疾病中的表达存在显著差异ꎮ此外ꎬ既往文献[１４]报道ꎬＥＲ在ＰＳＰ中呈高表达ꎬ而在肺腺癌中呈低表达ꎬ本实验结果与其一致ꎬ提示其可作为鉴别诊断二者的免疫组化指标ꎮ资料[１５]显示ꎬＫｉ－６７阳性细胞率是鉴别良㊁恶性肿瘤的常用免疫组化指标之一ꎮ本组资料显示肺腺癌中的Ｋｉ－６７表达显著高于ＰＳＰ(Ｐ<０.０５)ꎬ证实了此观点ꎮ本组资料显示ꎬ术中冰冻切片ＨＥ染色和术中冰冻切片快速免疫组化用于诊断ＰＳＰ的正确率分别为５８.３％㊁１００％(Ｐ<０.０５)ꎬ诊断肺腺癌的正确率分别为７６.９％㊁９６.２％(Ｐ＝０.０９９)ꎬ表明术中冰冻切片快速免疫组化可显著提高ＰＳＰ和肺腺癌诊断的正确率ꎮ通过对比ＴＴＦ－１㊁ＥＲ和Ｋｉ－６７在两种疾病中的差异表达结果:ＴＴＦ－１在１１例ＰＳＰ中表达增高ꎬ在１例肺腺
４９３１沈元龙等:术中冰冻切片快速免疫组化ＨＥ染色技术诊断硬化性肺细胞瘤和肺腺癌的应用对比㊀㊀第４０卷第１２期
２０１９年１２月
癌中表达增高(Ｐ<０.０５)ꎻＥＲ在１１例ＰＳＰ中表达增高ꎬ在２例肺腺癌中表达增高(Ｐ<０.０５)ꎻＫｉ－６７在
１０例ＰＳＰ中呈阴性ꎬ在２例肺腺癌中呈阴性(Ｐ<０.０５)ꎬ即ＴＴＦ－１㊁ＥＲ在ＰＳＰ冰冻切片中表达增高ꎬ而Ｋｉ－６７在肺腺癌冰冻切片中表达增高ꎬ进一步提示ＴＴＦ－１㊁ＥＲ和Ｋｉ－６７可作为术中冰冻切片快速免疫组化的指标对两种疾病进行鉴别诊断ꎮ此外ꎬ本组术中冰冻切片快速免疫组化结果与石蜡切片免疫组化染色结果对比显示ꎬ两者无明显差异(Ｐ>０.０５)ꎮ由此证实ꎬ术中冰冻切片快速免疫组化在提高诊断正确性的同时ꎬ可大幅缩短患者病理等待时间ꎬ为患者治疗方案的选择提供了帮助ꎮ但冰冻切片免疫组化势必会延长术中等待时间ꎬ且关于术中冰冻切片快速免疫组化在切片的固定㊁操作流程上并无统一标准ꎬ有待进一步研究及细化ꎮ
综上所述ꎬ术中冰冻切片快速免疫组化诊断ＰＳＰ和肺腺癌效果显著优于术中冰冻切片ＨＥ染色ꎬ免疫组化指标ＴＴＦ－１㊁ＥＲ和Ｋｉ－６７联合可作为术中冰冻切片快速免疫组化指标鉴别诊断ＰＳＰ和肺腺癌ꎮ
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(２０１９－０３－１６收稿)
(本文编辑:胡欣ꎬ刘菲)
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第４０卷第１２期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安㊀徽㊀医㊀学㊀２０１９年１２月㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀ＡｎｈｕｉＭｅｄｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ。